中科院青岛能源所丛志奇研究员 JACS：理性设计P450过加氧酶的隧道工程新策略

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细胞色素P450单加氧酶是自然界中最重要的氧化酶之一，广泛参与生物体内重要内、外源物质的合成与代谢，不但在医学和药学等生命健康领域得到广泛研究，而且其对极具挑战性的惰性碳-氢键选择氧化反应的优异催化能力，也激起合成化学与合成生物学等相关领域科学家的极大兴趣。大多数P450单加氧酶需要昂贵的辅因子NAD（P）H和复杂的氧化还原体系实现其催化功能，利用过氧化氢（H₂O₂）代替O₂将P450单加氧酶改造为过加氧酶，被认为是开发简单实用型P450生物催化剂的有效途径。但是绝大多数P450酶在H₂O₂存在下仅有极弱、甚至没有催化活性。
近日，中科院青岛生物能源与过程研究所丛志奇研究员在J. Am. Chem. Soc.期刊上发表了题为“Enabling Peroxygenase Activity in Cytochrome P450 Monooxygenases by Engineering Hydrogen Peroxide Tunnels”的文章（DOI:10.1021/jacs.3c00195）本论文提出通过P450酶的水隧道设计来促进H₂O₂进入其内部血红素活性中心，增强P450过加氧酶的催化活性。丛志奇研究员团队近年来在国际上首次提出双功能小分子协同P450酶催化概念，成功将P450单加氧酶改造为能高效利用H₂O₂的P450过加氧酶（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 7628. Very Important Paper），对苯乙烯、小分子烷烃、乙苯等多种反应显示出更好的催化活性。但研究人员发现其高活性大多建立在需要高出底物浓度数倍的H₂O₂投料基础上（理想情况下0化学计量比应为1：1），这对更具实用性P450酶催化剂的开发提出了新的挑战。基于上述挑战，丛志奇课题组近期将天然过氧化物酶与过加氧酶进行结构比对分析发现：天然过氧化物酶的血红素活性中心更多的暴露于蛋白表面，或者有较为开放的底物通道与蛋白表面相通，所以H₂O₂分子能够更容易到达活性中心。相反，烟酰胺辅因子NAD(P)H依赖型P450酶的活性中心大都深埋在蛋白内部，H₂O₂分子可能不容易通过疏水性底物通道进入活性中心，导致工程化P450过加氧酶在进行催化反应时通常需要高浓度的H₂O₂。鉴于P450酶结构中存在连接蛋白表面与活性中心的H₂O分子隧道（water tunnel），研究人员利用对P450酶的水隧道设计来促进H₂O₂进入其内部血红素活性中心，增强P450过加氧酶的催化活性。首先，研究人员利用Caver软件预测出P450酶血红素活性中心与溶剂环境之间的水隧道，并基于计算分析，鉴定出可能影响H₂O₂流入活性中心的隧道入口或瓶颈处的氨基酸残基，结合定点突变和多轮反应筛选，成功将两种NADH依赖型P450单加氧酶（CYP199A4和CYP153A_M.aq）改造为工程化P450过加氧酶，其催化活性比野生型酶分别调高183倍和15倍。图1 工程CYP199A4和CYP153A_M.aq的过加氧酶活性后续，研究研究人员还通过共结晶结构研究隧道工程提高P450过加氧酶活性的催化机制，揭示了水隧道工程策略的确有利于水或过氧化氢分子进入活性中心。图2 工程CYP199A4和CYP153A_M.aq水隧道的晶体结构最后，研究人员将上述策略应用到前期开发的双功能小分子协同P450BM3过加氧酶体系，获得预期产物所需H₂O₂浓度被降低了95%以上，且H₂O₂与产物的耦合效率达到95%。证明了水隧道工程策略可促进P450过加氧酶活性。图3 水隧道策略协同双功能小分子促进P450BM3过加氧酶活性上述工作为新型P450过加氧酶生物催化剂的开发提供了新的思路和工具，有望进一步拓展P450在合成化学和合成生物学中的应用空间。中国科学院青岛能源所博士生赵盼霞和孔繁慧，以及姜谊平博士为论文共同第一作者，丛志奇研究员为通讯作者。本研究得到国家自然科学基金和国家重点研发计划项目的大力支持。

作者简介

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丛志奇 研究员 博士生导师 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

2009年日本熊本大学理学博士，曾先后在分子科学研究所和名古屋大学从事博士后研究，2016年加入中国科学院青岛生物能源与过程研究所，任研究员、博士生导师，单碳酶催化研究组组长。先后主持国家自然科学基金、青岛市创新领军人才计划、国家重点研发计划子课题等10多项研究课题和题以第一和通讯作者在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Chem. Sci.等国际期刊发表论文30余篇。主要研究方向是酶化学生物学与合成生物学。在P450过加氧酶分子设计方面的研究成果被ChemistryViews、Faculty Opinions、和NaturalProduct Reports等国际学术组织和期刊作为研究亮点专题报道。

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.3c00195

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