真菌也可以功能预测？FUNGuild教你从ITS到功能分类

引言

自然界中真菌多种多样，广泛分布于各种生境中。近年来，高通量测序的普及使得大量的基于ITS（internal transcribed spacer）序列的真菌数据铺天盖地而来，极大的丰富了对环境中真菌多样性的认识。但通过这些数据很难解读环境中真菌的功能，因为缺少将真菌marker基因同其对应的物种功能联系起来的工具。

1前言 

今天卢瑟菌要跟大家介绍的就是把高通量/克隆文库等方法获得的真菌marker基因序列信息与真菌的生态功能联系起来的一款实用工具——FUNGuild ^[1]。它类似于目前根据16SrDNA高通量测序结果预测细菌、古菌群落生态功能的三款利器——PICRUSt^[2] 、Tax4Fun ^[3] 和最近发表在Science上的FAPROTAX^[4]（莫急，我们将在后续公众号更新中介绍这三款神器）。

由于FUNGuild的文章今年才发表，所以可能大部分人对它还不甚了解，但短短不到一年时间，该文章引用率已接近30次（据谷歌学术统计），足以见得其在真菌生态研究中的应用潜力。今天卢瑟菌抛砖引玉，把这款实用工具介绍给大家，希望对研究微生物生态，尤其是真菌生态的国内同行有所帮助和启发。

2开发历程 

最近原核研究领域，在将基因家族的功能预测与其系统进化分类联系起来的工作上取得了成功[2][3] [4]，但在有更大基因组、更少基因组测序信息的真菌上，仍然不能将其功能与物种分类联系起来（其实原因就是目前没有将两者联系起来的数据库呀！）。

物种分类好说，有现成的真菌数据库用来分类（比如基于ITS序列的UNITE数据库，卢瑟菌上次发文讲过哦，想了解戳这里），那功能怎么办呢？因为毕竟真菌完成基因组测序的数目相比细菌而言九牛一毛，所以走PICRUST的基于基因组的功能预测路线是行不通的[2]。换个思路，基因组预测既然走不通，那就干脆总结已有文献中对真菌功能的研究来进行分类呀（这很像FAPROTAX的开发思路哦[4]）！要解决这个问题就先要介绍一个生态学概念“guild”。

    “Guild”即“功能分组”（functional group），其概念早在1902年被提出，指某些物种，无论其系统进化上是否相关，但它们在对环境资源的吸收利用上采取相似的方式而被划分为同一类，这一类群即被称之为一个guild。Guild概念之所以吸引生态学家有很多原因，特别是因为其可以从复杂群落分类中提取出更易处理和理解的生态单位，因关注营养策略，所以还可以提供相比于物种丰富度和分类鉴定而不同的视角。另外，划分Gulid可以比较不同群落，甚至是当群落之间不存在直接重叠的物种时。

    既然guild有这么多好处，那就干脆将真菌进行guild分类得了。这可花了大工夫呢，作者基于目前已发表的文献或权威网站数据，首先根据营养方式将真菌分为三大类：

（1）病理营养型（pathotroph）——通过损害宿主细胞而获取营养（包括吞噬型真菌phagotrophs）；

（2）共生营养型（symbiotroph）——通过与宿主细胞交换资源来获取营养；

（3）腐生营养型（saprotroph）——通过降解死亡的宿主细胞来获取营养。

又进一步细分为12个guilds（按字母排序）：动物病原菌（animal pathogens）、丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）、外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi）、杜鹃花类菌根真菌（）、叶内生真菌（foliar endophytes）、地衣寄生真菌（）、地衣共生真菌（lichenized fungi）、菌寄生真菌（）、植物病原菌（plantpathogens）、未定义根内生真菌（undefined root endophytes）、未定义腐生真菌（undefined saprotrophs）和木质腐生真菌（wood saprotrophs）。还包括三类形态特殊的真菌：、facultativeyeast 和 thallus。这样功能分类就搞定了，再通过生物信息学脚本将物种分类与功能guild分类联系起来就大功告成啦（说起来很轻松的样子）！

这就是FUNGuild的开发历程。

太长不看版

作者为解决真菌分类与功能联系起来的问题，首先根据营养方式将真菌分为12类，然后构建了一个真菌分类和功能分组（guild）之间的数据库，通过这个数据库你就可以对真菌进行功能分类啦。也就是：

FUNGuild = Fungi + Functional + Guild

3使用方法 

（1）准备OTU表格

       可以手动准备，也可以直接用QIIME pepline生成的OTU表格。输入格式为.txt或.csv，示例如下：

（2）上传表格，开始分析

    进入主页http://www.stbates.org/guilds/app.php，将准备好的OTU表格上传，点击“Begin Analysis”，在线版分析速度为“含3000个OTUs的数据表格可在1min内完成解析，运行时间随OTUs数目线性增加”。

（3）结果输出

        运行结束后，在页面底端（如下截图示例）点击“Download full OTU file”即可获得功能分类结果。

（4）结果解读

        生成的结果示例如下表所示，其中前面几列就是你输入的OTU表格的信息，后面是由FUNGuild给出的结果，其中包括：

营养方式（Trophic mode）：即上面提到的病理营养型（pathotroph）、共生营养型（symbiotroph）和腐生营养型（saprotroph）三种类型；

Guild类型（Guild）：即上面提到的12种guild类型；

置信度（Confidence）：基于已发表文献或权威网站或作者实验室研究数据对分类结果给出可信度评估，分“极可能”（highly probable）、“很可能”（probable）和“可能”（possible）三个等级，初学者建议采纳前两种置信度的数据结果。

生长形态（Growth ）：即上面提到的除12种guild类型之外的3种生长形态类型（yeast、facultativeyeast和thallus）；

特征（Trait）：描述某些真菌的生长时的特征，如白腐（white rot）；

注释（Notes）：描述某些真菌的寄主类型、生境特征等；

引用/来源（Citation/Source）：对真菌进行功能guild划分的参考文献或网站信息。

4进一步分析及文章推荐 

拿到功能结果后，如何进一步分析呢？可以统计出不同guild的比例做柱状图、可以分析TOP丰度OTU的guild情况，也可以结合理化因子等对研究对象做出合理的解释与假设等等。卢瑟菌给大家推荐一篇今年Plos上的文献，这篇文章把FUNGuild结果用的是淋漓尽致，感兴趣的同行看以参考一下[5]。

让基于高通量测序的真菌生态研究不仅仅停留在多样性分析上，基于FUNGuild从生态功能视角剖析真菌生态，说不定会有意想不到的发现呢！

参考文献：

[1] Nguyen N H,Song Z, Bates S T, et al. [J]. Fungal Ecology, 2016, 20: 241-248.

[2] Langille M GI, Zaneveld J, Caporaso J G, et al. Predictive functional profiling ofmicrobial communities using 16S rRNA marker gene sequences[J]. Nature biotechnology, 2013, 31(9): 814-821.

[3] Aßhauer K P,Wemheuer B, Daniel R, et al. Tax4Fun: predicting functional profiles frommetagenomic 16S rRNA data[J]. Bioinformatics,2015, 31(17): 2882-2884.

[4] Louca S,Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global oceanmicrobiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277.

[5] Toju H, Kishida O, Katayama N, et al. Networks Depicting the Fine-Scale Co-Occurrences of Fungi in Soil Horizons[J]. PloS one, 2016, 11(11): e0165987.

公众号后台回复“FUNGuild”或“真菌功能预测”即可获得相关文献及示例数据啊！

既然都看到这里了，还不赞一下嘛