海洋可培养微生物的鉴定与分类
引言
观察和分类是研究微生物的基础。
海洋环境中蕴藏着丰富的微生物（基因）资源，种类繁多，分布广泛，功能多样，在驱动物质循环、能量流动和生物地球化学进程等方面扮演重要的角色。随着微生物学及分子生物学技术的不断进步，特别是基于高通量测序（high-throughput sequencing， HTS）技术而开展的海洋微生物的宏基因学研究以及生物信息学分析的发展，越来越多的海洋微生物新类群得以被发现和认识，比如海洋蠕虫共生菌delta1 symbiont和gamma3 symbiont的发现[1]。这些新颖的微生物的重要功能通过基因组注释得以揭示。其次，从新的生命之树（New Tree of Life）可以看到，微生物具有非常高的多样性，但绝大多数的微生物尚未得到培养 （isolate），尤其是纯培养（pure culture）。要深入研究海洋微生物的生理生化功能，及其与海洋动物的共生关系，首先需要培养这些微生物，而后从形态结构到表型特征，再到基因组的功能验证；这样才能更好的认识微生物。
图1. 生命之树（包括真核生物、古菌和细菌），引[2]。
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我主要应用宏基因组学的方法研究海洋动物共生微生物以及共生关系。在研究过程中，用可培养的方法，分离培养了许多新的海洋细菌，用微生物多相分类学方法（polyphasic classification）鉴定了几个新的微生物种类，发表过几篇鉴定的文章，因此，应师弟的热情邀请，总结一下海洋微生物（细菌）的鉴定和分类方面的基础知识。
要观察和认识微生物，分类是必不可少的，“物以类聚”就是这个道理。分类也是我们认识客观事物的基础。同时，为了认识微生物，也为了科学交流的方便，我们需要鉴定我们研究的这些微生物，同时给予其一个合理的名字。
首先，介绍一下概念：鉴定（identification）、分类（classification）和命名（nomenclature）。这个是微生物分类学的范畴，三者相互联系但又有点区别。分类，是根据微生物之间的相似性或者是亲缘关系，将微生物划分到一个合适的类群。鉴定，则是应用分类学的技术手段，确定微生物的分类地位（taxonomic position）。鉴定为一个新的分类单元（taxon）的时候，就需要给微生物进行命名。
其次，介绍下新种的鉴定和分类流程：
首先，16S rRNA基因序列相似度对新种的界定，没有明确的界限，即使是相似性为100%，从严格意义上来讲，也不能排除是新种的可能（只是可能性有点低而已）。一般而言，16S rRNA基因序列与其模式菌株的相似度在97%以下时，大概可以认为是一个新的分类单元。获取纯菌株后，通过抽提菌株的总DNA，用细菌通用引物扩增16S rRNA基因，而后克隆测序获取近全长序列（nearly full-length）。用该序列在EzBiocloud数据库（http://www.ezbiocloud.net/identify）和NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同时搜索序列相似度最高的序列。
查找相似度高的序列后构建系统发育树，可以判断为自己的菌株是否是新的分类单元了。
以下以自己分离的一株菌为列子，展示下EzBioCloud数据库比对结果和NCBI数据库比对结果。可以初步判断这一菌株为新的分类单元。
图3. nr数据库比对，未发现相似高的可培养菌
首先，构建系统发育树，通过系统发育树和16S rRNA基因比对的结果选择相近的模式菌株做参考菌株。在本例中菌株鉴定时，要选16S rRNA基因相似度最高的Marinibactrum halimedae Q-192（T）和系统发育树中亲缘关系近的Eionea flava IMCC1962（T），Eionea nigra 17X/A02/237（T），以及邻近分支的几株模式菌。
对于到底是分类到一个新种、新属、还是新科水平，要全面考虑，我认为目前没有统一的一个黄金标准。
图4. 系统发育树显示一菌株与模式菌株的亲缘关系
可以通过HPLC测定或者通过测序的基因组计算。我一般用基因组序列来计算GC含量。一般海洋细菌的基因组为3-5 M大小，所以测序500M - 1G的原始数据，非常容易拼接，拼接后的质量也很高。然后用相关的GC计算脚本或者软件即可计算。
如果待鉴定菌株和参考菌株有基因组序列，可以用在线工具Genome-to-Genome Distance Calculator（GGDC, http://ggdc.dsmz.de/）计算DDH（DNA-DNA hybridization），用在线工具EzBioCloud 数据库计算ANI（average nucleotide identify ）。DDH一般认为小于70%，ANI小于95-96%时，可以判读为一个新的分类单元。
不做详细介绍。
图5.模式菌Paraphotobacterium marinum NSCS20N07(T)菌落形态（左）和细胞形态（右）[3]
测定其生长的温度范围、盐度范围和pH范围。是否能够厌氧生长，抗生素敏感性（目前已不是强制指标）等等。
需要与选择的模式菌株，在同样的培养基和生长条件下进行培养。一般采用API系统的3种试剂条进行测定。API ZYM试剂条可以测定各种酶，API 20NE可以测定微生物利用的碳源；API 20E可以测定微生物发酵/氧化的各种糖类物质。模式菌株的获取，可以查找模式菌株保藏信息，从保藏中心获取模式菌株。
可以测定对各种底物的降解功能的验证。比如，降解琼脂、纤维素、淀粉等。
与模式菌株在同样的培养基和培养条件下培养后收集菌体，用传统的方法抽提脂肪酸，用标准的MIDI protocol (Sherlock Microbial Identification System, version 6B)进行测定。
醌的测定采用经典的reversed-phase HPLC [4]。
图6. HPLC测定呼吸醌
通过峰高，峰面积，以及标准品的对照，可以判断为Q-8.
首先要提取磷脂，后用双相TLC板展层，用不同的显色试剂分析。
图7. 磷脂测定用的TLC板示意图（显示上样位置，第一相和第二相的方向）
对于某些细菌的鉴定，还需要测定一些特定的指标，比如细菌色素种类、运动性，以及细胞壁成分（放线菌和芽孢杆菌的鉴定）等。
不做详细介绍。
鉴定后需要将菌株保藏（deposition）在至少两个国家的菌种保藏中心，获得菌株保藏编号以及保藏证书（certificate）。
经过一系列的鉴定结果，需要对新分类单元进行详细的描述。如下：
细胞形态、大小、运动性；在培养基平板上菌落的形态、颜色、色素；生长培养基；温度、pH和盐度（NaCl浓度）的生长范围和最适范围；生化特性；抗生素敏感性；化学组成，包括脂肪酸组成、极性脂组成、醌的种类；DNA G+C含量；模式菌株。所有的描述采用现在时态（present tense）。
最后，由于本人研究水平有限，也并非微生物分类学的专家，错误之处请多批评指正。
另外，介绍下中国海洋微生物菌种保藏管理中心（Marine Culture Collection of China, MCCC）。该中心成立于2004年，挂靠于国家海洋局第三海洋研究所，是专业从事海洋微生物菌种资源保藏管理的公益基础性资源保藏机构，负责全国海洋微生物菌种资源的收集、整理、鉴定、保藏、供应与国际交流。
MCCC菌种库中的菌株包括模式菌株数量正逐步增大，而且主要分离自海洋环境，您可以登陆MCCC网站（http://mccc.org.cn/）的菌种搜索里面查找相关的模式菌株。
图8. 中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）网站主页截图
参考文献
1.Woyke T, Teeling H, Ivanova NN, Huntemann M, Richter M et al. Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortium. Nature 2006;443:950-955.
2.Hug LA, Baker BJ, Anantharaman K, Brown CT, Probst AJ et al. A new view of the tree of life. Nat Microbiol 2016;1:16048.
3.Huang Z, Dong C, Shao Z. Paraphotobacterium marinum gen. nov., sp. nov., a new member of the family Vibrionaceae, isolated from the surface seawater of the South China Sea. Int J Syst Evol Microbiol 2016.
4.Komagata K, Suzuki K. Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics. Methods in Microbiology 1987;19:161-207.
进一步阅读：
Tindall, B. J., Rossello-Mora, R., Busse, H. J., Ludwig, W. and Kampfer, P. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes. Int J Syst Evol Microbiol. 2010. 60. 249-66.
作者简介
黄兆斌，博士生，主要研究兴趣：海洋贝类共生微生物及共生关系；海洋微生物分类、基因组及系统进化。E-mail：zbhuang@xmu.edu.cn
致谢
特别感谢国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源重点实验室博士生刘阳、李贵珍对本文的审阅、修改。
本期排版：李小圆
本期校稿：卢瑟菌 小丸子 小超人