利用稳定同位素探针（SIP）揭示不可培养微生物的功能

目前我们已经知道，对于微生物世界而言，我们知之甚少。通过不依赖于传统培养技术的宏基因组以及不断发展的生物信息学手段，如今我们已经将最初组成上寥寥无几的生命之树推演的非常复杂，比如图1是Jillian F. Banfield课题组制作的生命之树。但是我们也深刻地认识到如何解释这些不可培养微生物的功能，是一件非常困难的事情。尽管基因组技术让我们知道他们的存在，但是我们很难继续通过这一手段解释他们的功能。比较明显的挑战是，很多时候在我们进行基因序列注释（annotation）的时候，发现其实根本就没有相近的序列可以提供参考依据。这就使得很多需要依赖于基因的技术手段黯然失色，比如蛋白组或者转录组，除非你可以提供比较合理和相近的对照组。也正是基于此，越来越多的科学家，决定从野外（field）走进实验室（lab）来尝试培养这些微生物，比如图1所示的CPR类细菌和DPANN类古菌。当然，我们都知道大多数情况下获得纯菌（pure isolate）是几乎不可能完成的事情，所以如何将适用于纯菌的传统生物技术手段转接到混合菌群（mixedculture or enrichment culture）或者探寻更加“smart”的手段是大家需要解决的一件事情。

图1 生命之树。其中包括众多的不可培养微生物，比如Candidate Phyla Radiation (CPR) 类细菌和DPANN类古菌 (包括Diapherotrites, Parvarchaeota, Aenigmarchaeota, Nanoarchaeota, Nanohaloarchaea)。摘自Hug et al. (2016)。 

上个世纪末J. Colin Murrell课题组提出的稳定同位素探针（stable isotope probing，SIP）为解决这一个问题（who is doing what?）提供了一个特别有效的思路。历经将近二十年的发展，我们见证了这一方法的发展壮大。对于SIP，在稳定同位素使用方面，较常使用的同位素为碳同位素（¹³C），也可以使用氮同位素（¹⁵N）或者氧同位素（¹⁸O）等；在所检测的分子层面，既可以针对DNA（比如16S rRNA gene或者功能基因，亦或metagenomics）, 还可以针对mRNA（metatranscriptomics）或者蛋白质（proteomics）；在细胞水平，你还可以用于单细胞水平（single cell stable isotope probing）。本文将简单介绍DNA-¹³C-SIP，希望可以抛砖引玉，引起大家对于这一技术手段的重视。

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图2 通过¹³C标记的碳源并通过吸收¹³C的DNA来区分谁是主要的碳源利用者。摘自YouTube视频，作者不详。

我们先通过一个简单的例子来理解下SIP的基本原理（图2）。首先，如果你想要进行这样一个实验，必须得有高度标记的¹³C化合物。注意：一般来讲，这样的¹³C化合物是比较难以得到或者不能通过药剂公司购买到，所以这可能是这一技术手段的一个重要局限性。最早被利用来做SIP实验的物质是¹³CH₃OH + ¹³CH₄。他们的纯度是> 99 atom% ¹³C（Radajewski et al., 2000，注意单位的理解，建议简单了解下同位素的背景知识），请注意理论上纯度越高越有利于后续的实验。将它们加入到土壤样品或者富集培养微生物中，经过一段时间的培养，能够利用甲烷或者甲醇的微生物会将¹³C整合到自己的DNA中。接下来，我们需要将微生物的DNA提取出来，然后采用氯化铯密度梯度离心法（caesium chloride buoyantdensity-gradient centrifugation，可以参看百度百科）来分离¹³C标记的DNA和¹²C-DNA。如图3，在向含有扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）的纯菌培养基中分别：（1）只添加¹³CH₃OH（¹³C），（2）只添加¹²CH₃OH（¹²C），或者（3）添加¹³CH₃OH + ¹²CH₃OH混合物（mixture），利用氯化铯分离法，我们可以非常容易地将DNA条带按照不同标记的同位素分离开来。但是对于环境样品（比如土壤样品或者混合菌群培养物），考虑到GC含量和扩散等因素，DNA条带可能不会这么清晰和干净，所以一定需要没有标记的对照组来进行对比（如图2）。获取¹³C标记的DNA之后，接着可以利用传统的PCR方法来扩增16S rRNA基因或者功能基因，或者直接对genomic DNA测序获得宏基因组数据（图2）。在此，具体不做叙述。

图3 通过氯化铯密度梯度离心法将只含有细菌Methylobacterium extorquens纯培养物（pure culture）样品的DNA清晰地分成：（1）只含有¹³C-DNA条带（只添加¹³CH₃OH实验组）；（2）只含有¹²C的DNA条带（只添加¹²CH₃OH实验组）；（3）中间的显示含有¹³C-DNA和¹²C的DNA条带（（添加¹³CH₃OH + ¹²CH₃OH混合物实验组）。摘自Radajewski et al. (2000)。

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接下来我们再举一个简单但是流程比较全的例子，这是国内某课题组发表在Environmental Science & Technology上的关于好氧条件下降解菲的DNA-SIP实验（Li et al., 2017，如图4）。该实验采用全部标记的菲（¹³C14−Phenanthrene, 99%，价格非常昂贵！）。

图4 通过耦合培养手段和非培养技术（DNA-SIP）解释多环芳烃污染废水中菲的生物降解。摘自Li et al. (2017)。

通过加入标记菲和无标记菲两组进行对比培养实验，来找出可以降解菲的主要微生物。经过三天培养之后，Li et al.利用PowerSoil DNA Isolation Kit从两组实验中提取DNA，然后与含有氯化铯的溶液混合。

图5 不同标记DNA分子的分离步骤（ultracentrifugation + fractionation）。从试管1到12，浮力密度逐渐增高。摘自Jameson et al. (2017)。

之后借助超高速离心机和注射泵（syringe pump）进行长时间的超高速离心（一般两天以上）和不同浮力密度（buoyant density，BD）DNA的分离，获得12-14个DNA fractions（图5），测得它们的浮力密度，最后沉淀DNA继续进行16S rRNA gene高通量测序，根据相对含量的对比来确定谁是降解菌（如何分析需要具体情况具体分析，可以参考文后的文献）。也可以先进行DGGE或者TRFLP，然后进行测序如国外某课题组关于厌氧降解甲苯的文章（Abu Laban et al. 2015）。

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再举一个利用功能基因的SIP实验，图6为日本某课题组发表在Water Research上的研究。他们利用¹³C标记的碳酸氢钠（较为便宜）作为标记物来研究自养微生物的生长，包括氨氧化细菌和古菌。方法类似Abu Laban et al. 2015文献，即通过对标记和未标记的古菌或细菌的氨氧化关键功能基因——amoA基因的qPCR、TRFLP及高通量测序等揭示自养氨氧化功能类群。

图6 通过DNA-SIP评估用于饮用水净化的颗粒活性炭中氨氧化细菌或者古菌的自养生长。摘自Niu et al. (2013）。

     结语   

如果希望利用SIP做实验，可以参考下面所列的protocol（如果没有权限下载，可以向作者写邮件或者利用http://sci-hub.bz/）。如果实验过程遇到问题或者希望通过合作方式来完成SIP实验，建议直接向protocol的任何作者写邮件，他们可以提供非常有效的帮助或者建议。

涉及SIP较详细protocol的文献推荐：

[1] Neufeld JD, Vohra J, Dumont MG, Lueders T, Manefield M,Friedrich MW et al (2007). DNA stable-isotope probing. Nature Protocols 2: 860-866.

[2] Whiteley AS, Thomson B, Lueders T, Manefield M (2007). RNA stable-isotope probing. Nature Protocols 2: 838-844.

[3] Lueders T (2010). Stable isotope probing of hydrocarbon-degraders. In: Timmis KN (ed). Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Springer Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. pp 4011-4026.

[4] Jehmlich N, Schmidt F, Taubert M, Seifert J, Bastida F,von Bergen M et al (2010). Protein-basedstable isotope probing. Nature Protocols 5: 1957-1966.

[5] Shao Y, Arias-Cordero EM, Boland W (2013). Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using ¹³C-Glucose. JoVE: e50734.

[6] Jameson E, Taubert M, Coyotzi S, Chen Y, Eyice Ö, SchäferH et al (2017). DNA-, RNA-,and Protein-based stable-isotope probing for high-throughput biomarker analysisof active microorganisms. In: Streit WR, Daniel R (eds). Metagenomics: Methods and Protocols. Springer New York: New York,NY. pp 57-74.

参考文献

Radajewski S, Ineson P, Parekh NR, Murrell JC (2000). Stable-isotope probingas a tool in microbial ecology. Nature 403: 646-649.

Dumont MG, Murrell JC (2005). Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nature Review Microbiology 3: 499-504.

Niu J, Kasuga I, Kurisu F, Furumai H, Shigeeda T (2013). Evaluation ofautotrophic growth of ammonia-oxidizers associated with granular activated carbon used for drinking water purification by DNA-stable isotope probing. Water Research 47: 7053-7065.

Abu Laban N, Dao A, Foght J (2015). DNA stable-isotope probing of oil sandstailings pond enrichment cultures reveals different key players for toluene degradation under methanogenic and sulfidogenic conditions. FEMS Microbiology Ecology 91: fiv039-fiv039.

Hug LA, Baker BJ, Anantharaman K, Brown CT, Probst AJ, Castelle CJ et al (2016). A new view of the tree of life. Nature Microbiology 1: 16048.

Li J, Luo C, Song M, Dai Q, Jiang L, Zhang D et al (2017). Biodegradation of phenanthrene in polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated wastewater revealed by coupling cultivation-dependent and -independent approaches. Environmental Science & Technology 51: 3391-3401.

作者简介:

董西洋，现为Helmholtz Zentrum München / University of Duisburg-Essen（德国）博士研究生。博士期间研究领域为芳香烃化合物的厌氧降解，主要利用基因组、蛋白组、同位素标记、生物电化学和基本的生理生化实验等手段来研究厌氧降解的机理以及微生物群落中不同微生物之间的联系。博士后研究将在University of Calgary（加拿大）开展，课题涉及海洋微生物生态以及碳水化合物的降解研究。2017年5月加入“微生物生态”公众号编辑部。

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本期排版：坚果儿

本期校稿：卢瑟菌