两种土壤细菌群落结构高通量绝对定量方法
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1. 研究背景
在宏观生态学研究中，物种的种类、物种绝对含量和物种相对丰度是描述群落结构的三个必备指标。聚焦土壤微生物生态研究，高通量测序分析技术极大拓宽了我们对微生物群落结构及功能的认识。但目前高通量测序分析结果往往只有微生物分类及其相对丰度，而不同分类水平微生物的绝对含量却不能获得。微生物的相对丰度只表征了一个样本中微生物类群的相对比例，但目前大多数研究往往误用相对丰度来进行跨样本间微生物丰度的比较，当样本间总微生物绝对含量存在差异时，可能会得出相反的结论（图1）。为解决高通量测序分析技术的这一局限性，本文将介绍两种土壤细菌群落结构高通量绝对定量方法（HAAQ, High-throughput Absolute Abundance Quantification），为实现“宏观微生物生态”更完整、深入的研究提供新方法。
图1 相对丰度与绝对含量跨样本比较差异示意图
2. 方法流程
方法一[1]：向供试土壤中添加适量的（105~107个细胞/克干土）内标菌株Escherichia coli O157:H7 HAAQ-GFP，混匀后提取土壤DNA，然后进行16S rRNA基因高通量测序分析。根据内标菌株HAAQ-GFP已知的绝对量及其高通量测序分析获得的相对量，计算出土壤细菌总量、不同分类水平细菌的绝对含量，样本一次测定即可同时获得土壤细菌分类、相对丰度和绝对含量等信息（图2-HAAQ）。
方法二[2]：针对有些实验室获取内标菌株困难或DNA样品已通过高通量测序获得了微生物分类及其相对丰度信息的实际情况，我们提出并验证了iHAAQ（Integrated High-Throughput Absolute Abundance Quantification）方法获得样品细菌群落的绝对含量。其主要原理为：利用与高通量测序相同的引物对DNA样品进行荧光定量PCR（qPCR），从而获得样品的细菌绝对总量，再与高通量测序所得的相对丰度相乘即可获得不同分类水平细菌的绝对含量（图2 iHAAQ）。
图2 HAAQ与iHAAQ方法流程
3. 研究结果
将HAAQ和iHAAQ方法分别应用于土壤及其母质（紫砂岩）、叠氮化钠抑菌剂处理土壤、菲污染土壤中细菌群落变化的研究，都发现了土壤细菌相对丰度和绝对含量变化趋势相反的现象（图3），绝对含量可比相对丰度更好地揭示跨样本间微生物的变化（图4）。同时，我们首次报道了土壤细菌在属水平的浓度服从偏对数正态分布，绝大部分的细菌浓度为103.5~106.5个细胞/克干土（图5）。基于本研究分析方法及测序深度等，测试样本的土壤微生物“暗箱”中低于103个细胞/克干土（相对丰度约为万分之一）的细菌仍难以被检测。
图3. HAAQ法揭示叠氮化钠处理土壤的细菌群落变化
图中，I表示细菌属相对丰度增加而绝对含量降低；II和III分别表示细菌属相对丰度和绝对含量同时降低或增加。
图4 菲污染土壤修复中细菌群落相对丰度（A）和绝对含量（B）热图
图中，0和28表示处理时间0天和28天；P表示添加菲处理组；S表示添加叠氮化钠处理组；W表示添加Massilia sp.WG5处理组。
图5 土壤属水平细菌浓度分布情况
图中S0和S14分别表示土壤添加叠氮化钠后培养0天和14天。
4. 总结
通过HAAQ和iHAAQ法获得的土壤细菌分类、相对丰度和绝对含量等信息，可更方便、更完全地揭示微生物群落及其变化，为进一步研究土壤微生物数量生态学提供了新的方法和支撑。
5. 参考文献
[1] Yang L., Lou J., Wang H. Z., Wu L.S., Xu J. M., 2018. Use of an improved high-throughput absolute abundancequantification method to characterize soil bacterial community and dynamics.Science of the Total Environment 633, 360-671. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.03.201
[2] Lou J., Yang L., Wang H. Z., Wu L. S., Xu J. M., 2018. Assessing soil bacterial community and dynamics by integratedhigh-throughput absolute abundance quantification. PeerJ 6, e4514. https://doi.org/10.7717/peerj.4514
作者信息：
Q&A
1卢瑟菌：
土壤本底E.coli是否会影响结果？如何消除影响？
作者：
参考文献中发表于Science of the Total Environment的那篇文章中有针对该问题进行讨论。文章中有设置Control对照组，即添加等体积无菌水作为对照，同时进行高通量测序，因此可将本底E.coli扣减。与此同时，我们采用了两个公式平行计算属水平的绝对含量，其中公式之一，将Control中测得的E.coli扣减，另一公式中默认土壤本底E.coli为零。两个公式分别计算出的绝对含量除了E.coli所在属有显著差异，其他属的均无显著差异。也即表明，在无粪肥添加的天然土壤中大肠杆菌自然丰度较低，即使忽略对计算结果影响也较小。
2卢瑟菌：
为何构建含GFP菌株后通过显微镜计数来对内标菌株进行定量，直接染色或通过测定OD值是否更简单？
作者：
对于菌液中内标菌株的定量，直接染色或OD测定都可以。但在我们论文研究中，既要对添加到土壤前的菌液中菌体定量，也要对添加到土壤后的内标菌株进行定量。用染色法、OD值无法对土壤中内标菌株进行专一性定量，而用GFP标记后可对内标菌株和土著微生物进行区分。所以，为确保土壤中内标菌株的计数，我们研究中选用GFP标记。
有关土壤微生物定量为数不多的文献中，对选用添加前还是添加后的内标定量并未见详细报道。基于此，我们采用了三种方法同时对添加土壤前菌液中和添加土壤后HAAQ-GFP进行绝对定量：显微镜计数、平板计数和qPCR。GFP标记的优势在于，它不仅能使菌体细胞荧光标记，方便荧光显微镜计数定量；同时，GFP质粒上还具有Amp抗生素基因，使得菌体具有氨苄青霉素的抗性，方便添加至土壤后还能提取出来用于平板（含氨苄青霉素）计数。根据三种方法的结果，我们发现一旦内标菌株被添加进土壤后，再提取出来都会存在较大的损失，所以最后得出结论是采用添加前显微镜计数结果，最为接近添加的真实值，也更能揭示出本底细菌的真实含量。
3卢瑟菌：
内标菌的GFP在死菌中应该不表达，因此计数时死菌会被忽略；但其16S rDNA往往仍会在后续高通量测序中被检测到，即HAAQ方法是否会在对内标菌定量时，因只能区分活菌而可能低估其细胞数？
作者：
文章中，我们有对细菌液体培养中HAAQ-GFP同时进行平板计数和显微镜计数，假设如果存在不表达GFP的死菌，即检测不到荧光且死亡不生长，那显微镜计数结果应当是等于平板计数结果的。而所得结果中，显微镜计数结果值>平板计数结果，这反而表明了细菌的活的不可培养的状态（viablebut non-culturable states）。所以，问题中所假设的情况，在我们研究中存在的可能性较小。
之前也有阅读过研究环境样品中死菌DNA的报道，也有学者提出相应的解决手段，如果要考虑添加的内标菌中的死菌，也需等同考虑环境中的死菌DNA，那就又是另外一篇文章啦~
4卢瑟菌：
通过HAAQ-GFP方法进行绝对定量时，是否每个样品都要设置对照组？这样的话就不太适合大样本量了。
作者：
如问题1回答中，天然土壤中E.coli丰度较低，可忽略不计，对计算结果没有显著影响。所以，大肠杆菌未污染的天然土壤使用HAAQ方法进行定量，不需要设置对照组。另外，为了使得内标法普适性更强，我们正在想办法解决这个问题，敬请期待~
5卢瑟菌：
与公众号以前发表的类似方法相比，有哪些优势？（见公众号历史文章“内标法测序研究生物炭对大豆土壤细菌群落的影响”）
作者：
以前发表在公众号的文章“内标法测序研究生物炭对大豆土壤细菌群落的影响”参引的是Smet et al. (Soil Biology & Biochemistry, 2016, 96, 145–151)方法，以Aliivibrio fischeri的DNA作为内标物质添加至土壤样品中，再进行土壤DNA提取的步骤。有研究表明土壤对细胞和胞外DNA的吸附是不同的，从而土壤DNA提取步骤对本底细胞的提取和Aliivibrio fischeri DNA的再次提取效率可能是不同的，便影响了后续以此为基础的估计准确性。我们HAAQ方法的内标是菌株细胞，更为接近土壤本底的细菌，从而使得提取效率更为接近。与此同时，我们在添加前便对内标菌株进行定量，将后续损失步骤包括在内，从而使得计算值更为接近本底真实值。另外，iHAAQ方法则是利用高通量测序的相同引物对DNA样品进行qPCR测定分析获得微生物总量，再与高通量测序结果中相对丰度相乘，即可获得不同分类水平微生物的绝对含量。对已通过高通量测序获得了微生物分类及其相对丰度信息的样品，后续通过iHAAQ方法可补充获得不同分类水平微生物的绝对含量。
6卢瑟菌：
E.coli及环境中绝大多数微生物的16S并非单拷贝，本文方法是否考虑该因素？16S多拷贝会对本文方法有何影响？
作者：
我们也考虑到了这个问题，所以论文中数据同步采用了RDP数据库分析，对16S rRNA基因拷贝数进行一个校正，从而使得计算结果更为精准。详细内容见参考文献[1]原文。
7卢瑟菌：
请指明文中方法的适用范围及有待完善之处。
作者：
两种方法仅对细菌域进行了验证，古菌域与真菌域微生物绝对定量有待进一步开发和验证。
关联文章：
致谢
特别感谢国家海洋局第三海洋研究所黄兆斌博士对本文的细致审阅及修改！
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本期审校：卢瑟菌
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