干货：浅谈微生物生态研究中的16S rRNA基因

16S rRNA (Smallsubunit ribosomal RNA)基因存在于所有原核微生物（细菌&古菌）中，是目前研究原核微生物多样性最常用、最准确的分子标尺，被广泛应用于海洋、土壤、肠道等各种生境微生物多样性的研究中。然而，16S作为分子标尺研究多样性的过程中也存在诸多问题，今天卢瑟菌大觉主就跟大家一起聊一下微生物生态研究中的16S。

1. 16S rRNA基因为什么能区分不同微生物？

这与16S rRNA基因的特殊结构有关，其基因结构示意图如下图1。基因全长1500bp左右，基因序列包括间隔分布的保守区和可变区，对于细菌一般包括9个保守区（C1-C9）和9个可变区（V1-V9）。不同种类的细菌有相同的保守区序列和不同的可变区序列，因此可以根据保守区序列设计引物来扩增环境样品中所有细菌16SrRNA基因，而根据可变区序列来区分不同种类的细菌。

2. 基于16S rRNA基因研究微生物多样性的方法有哪些？

按照发展历史可以分为两大类：传统研究方法和基于高通量测序的研究方法。传统方法如下表1所示，比较经典且常用的传统研究方法如16S rRNA基因克隆文库法、TRFLP、DGGE等。但传统方法的缺点是通量低、花费大，随着高通量测序技术的到来，现在主流的微生物多样性研究方法都是基于高通量测序技术，传统方法已经逐渐被淘汰或者成为次要的辅助方法。

3. 目前高通量测序平台有哪些？

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又名二代测序(Next generation sequencing, NGS)，是相对于第一代Sanger测序法而得名。较早的高通量测序平台是Roche公司的454焦磷酸测序平台，最大优势是读长长，通量较高；但随着Illumina公司的崛起，其旗下的各种测序平台是目前主流高通量测序技术，读长不断增长、通量也不断提高，因此454测序平台已濒临淘汰。最近，PacBio与ZSGenetics公司研发的第三代测序技术也初见端倪，又名单分子测序技术，即DNA测序时不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，但价格相对较高。二代测序的高通量测序平台一览见下表2。

4. 基于16S rRNA的测序引物有哪些？

传统方法中最常用的引物是27F和1492R，几乎能扩增出完整的16S rRNA基因全长，由于目前高通量测序的读长限制，该引物不适用于高通量测序平台，但被广泛用于纯菌的分子鉴定。目前，较常用于高通量测序平台的引物如下表3。更多引物选择请见文末推荐的网站。

5. 基于16S rRNA基因的微生物生态研究策略是什么？

环境微生物生态研究主要关注的两大问题是：环境中有什么微生物？有多少？基于此，微生物生态的研究策略如下图2所示。其中荧光定量PCR和FISH技术能回答有多少微生物，而指纹图谱技术、高通量测序和基因芯片能回答环境中有什么微生物。

6. 基于16S rRNA基因研究微生物生态有哪些局限性？

（1）对于某些属的菌群分辨效果较差，如Vibrio、Pseudomonas等；

（2）通常设定16S rRNA基因序列相似性≥97%的原核生物为同一个种，但很多不同种的微生物其16S rRNA基因序列相似性却高于97%；

（3）许多细菌的16S rRNA 基因是多拷贝的，而且各拷贝的序列间存在一些差异；

（4）16S rRNA基因存在水平转移问题。

7. 16S rRNA分析的常用网站有哪些？

比较常用的如NCBI的BLAST，可对16S序列与数据库中的序列进行相似性比对；常见的16S数据库还有SILVA、RDP和Greengenes等，都可对16S进行序列比对和分类鉴定。

最后给大家特别推荐几个比较实用的有关16S的网站：

1. probeBase——最全的16S rRNA基因引物或探针数据库

网址：http://probebase.csb.univie.ac.at/

用途：该网站收录了大量16S相关的引物和探针，并能评估引物对微生物扩增的特异性和覆盖度，是目前最全面的16S引物/探针数据库。

2. ezbiocloud——16S模式种比对网站

网址：http://www.ezbiocloud.net/eztaxon

用途：根据16S rRNA基因序列，同源比对后，找出相似性最高的培养株模式种。

3. rrnDB——16S rRNA基因拷贝数查询利器

网址：https://rrndb.umms.med.umich.edu/

用途：基于已发表的基因组数据，查找细菌或古菌不同物种中的16S rRNA基因拷贝数。

主要参考文献：

[1]刘驰, 李家宝, 芮俊鹏, 等. 16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用: 现状和问题[J]. 生态学报, 2015, 35(9).

[2]Loy A, Horn M, Wagner M. probeBase: an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(1): 514-516.

[3] Stoddard S F, Smith B J, Hein R, et al. rrnDB: improved tools for interpreting rRNA gene abundance in bacteria and archaea and a new foundation for future development[J]. Nucleic acids research, 2014: gku1201.