用16S rRNA反映微生物群落活性？谨慎为之！

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上次卢瑟菌大觉主和大家聊了强大的16S rRNA在微生物生态研究中的各种知识，目前绝大多数16S相关的多样性文章都是在DNA水平（即16S rRNA基因）做的，但DNA水平存在一个问题就是不能排除已经死去但DNA并未降解的死菌，这部分死菌已经失去了其原有的生态功能，但通过16S rRNA基因在DNA水平上的多样性研究却无法对其进行区分。于是有学者提出在RNA水平进行微生物群落研究，死菌RNA会很快降解，这样就能用16S rRNA反应微生物群落活性了。目前，已有超过100篇的文章通过16S rRNA来鉴定微生物的生长或活性。但用16S rRNA真的准确反映微生物群落活性吗？今天卢瑟菌将通过一篇文章继续和大家聊聊16S。

该文章发表在微生物生态学顶级期刊the ISME journal上，题目为“评价rRNA在环境微生物群落研究中作为微生物活性指标的局限性和应用”(Evaluating rRNA as an indicator of microbial activity in environmental communities: limitations and uses)。微生物通常以各种不同的代谢状态存在（如休眠、分裂、死亡等），分析16S rRNA通常被用来研究环境中微生物的活性状态。但对16S rRNA的分析通常不能准确地对混合群落中的菌群生长速率进行定量，因为16S rRNA含量在不同微生物间通常不与其生长速率成线性比例关系，很多证据也表明该方法存在严重的局限性。本文重点指出了：16S rRNA和微生物活性、生长之间通常有着复杂、甚至相反的关系！

1. 对微生物代谢状态分类并总结其生态功能

文章作者将环境中的微生物，根据其代谢状态分为了四个时期：生长期、活性期、休眠期和死亡期，不同时期的生态功能存在较大差异（如下图1），其rRNA含量当然也存在较大不同。环境中微生物群落是这四种时期菌体的集合，因此单单通过rRNA表征微生物代谢活性的准确性较低。

图1 微生物代谢状态和其对生态功能的贡献

生长期(Growing)：指细菌处于活跃的分裂期；活性期(Active)：指细菌有适度的合成与分解代谢但不分裂；休眠期(Dormant)：指细菌代谢几乎停滞且不分裂；死亡期(Deceased)：指细菌永久失去代谢活性，但可能仍保存有完整的DNA分子。

2. 16S rRNA衡量微生物群落活性的存在的局限性

（1）即使在单一菌群中，16S rRNA含量和微生物生长率、活性间也并非简单的线性正相关关系！

最早关于rRNA含量和微生物活性间的关系是通过对纯培养物研究获得的，而结果表明即使在稳定生长的状态下，生长率和rRNA浓度间通常也关系不明确。如聚球藻属(Synechococcus)和原绿球藻(Prochlorococcus)在稳定生长时，其生长率和rRNA浓度存在三种情况：a. 低生长率时，rRNA浓度保持恒定；b. 中等生长率时，rRNA浓度随生长速率而线性增加；c. 较高生长率时，rRNA量随生长率增加而减少(Binder and Liu, 1998; Worden and Binder, 2003)。对非稳定生长条件下，变形菌门(Proteobacteria) 的菌株研究发现，细菌生长率总是滞后于rRNA浓度或无明显关系。而对费氏弧菌(Vibrio fischeri)的研究却发现随rRNA浓度增加而生长率降低的情况。此外，rRNA浓度不仅受当前状态影响，还受过去经历的生活史影响。

（2）16S rRNA含量和微生物生长率、活性间的关系因物种差异而存在显著差异。

当涉及到不同微生物混合菌群时，rRNA含量和活性间的关系就更问题多多了。即使在相似性很高的亚种间16S rRNA含量和代谢活性间的关系也存在显著差异，因此通过rRNA来比较不同微生物间的代谢活性可能得到错误的结果。

（3）即使处于休眠状态的细菌也包含大量的核糖体rRNA！

处于休眠状态的细菌其代谢活性极低，但细胞内也包含大量的核糖体rRNA，有时甚至比活性期的细胞中含量还要高(Sukenik et al., 2012)！因此，环境中包含的休眠微生物会影响通过rRNA评估微生物活性的准确性。为解决该问题，一种降低休眠细胞中rRNA影响的方法是：计算rRNA与rRNA基因的比值，然后划定一个最小活性阈值(DeAngelis et al., 2011; Jones and Lennon, 2010)。

（4）细菌活性期(active)和rRNA含量间关系的研究还未见报道。

3. 影响核糖体数量及其与微生物活性间关系的因素

图2 从核糖体循环到微生物活性：影响核糖体数量和其与微生物活性间关系的因素

生存策略指为实现生存和繁殖两大矛盾目的而作出的潜在生理响应。

图2总结了在核糖体循环过程中，可能影响核糖体数量（即rRNA数量）及其与微生物活性间关系的因素。过程的烦杂及影响因素众多使得用16S rRNA含量反映微生物代谢活性的难度增大、准确度降低。一个关于细菌生存策略影响rRNA数量的有趣例子是：通过对地中海土壤微生物群落的研究发现，夏季干旱末期，几乎检测不到微生物群落的代谢活性（通过CO2产生量来检测），但细菌16S rRNA的量和经过第一次雨季后活跃代谢时的16S量相当(Placella et al., 2012)，这可能反映了细菌对雨季到来的预期(Barnard et al., 2013)。

4. 对你将来研究的建议

你近期的研究如果有利用16S rRNA含量来反映微生物群落活性的打算，请谨慎设计实验，由上面卢瑟菌的介绍可知，单单凭16S来反映微生物群落活性的可信度较低甚至会得出错误的结论，建议结合相关过程的速率测定、酶活测定、呼吸代谢速率等方法从多个角度来共同说明问题！

主要参考文献：Blazewicz S J, Barnard R L, Daly R A, et al. Evaluating rRNA as an indicator of microbial activity in environmental communities: limitations and uses[J]. The ISME journal, 2013, 7(11): 2061-2068. 另：文中提到的其他文献均可在该文章中找到。

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