前沿文献 | 血浆游离DNA极深高通量测序助力包虫病精准诊断及其治疗情况监测

引言

华大基因联合中日友好医院、华南理工大学、西藏自治区第二人民医院、西藏疾控中心等多家单位于2020年先后在国际知名期刊 《PLOS Neglected Tropical Diseases》（IF=4.4，JCR=Q1，热带医学TOP1）、《Genomics》（IF=6.2，JCR=Q2）上发表研究论文《Comprehensive characterization of plasma cell-free Echinococcus spp. DNA in echinococcosis patients using ultra-highthroughput sequencing》、《Characterizing dynamic changes of plasma cell-free Echinococcus granulosus DNA before and after cystic echinococcosis treatment initiation》，阐述了研究人员首次利用极深高通量测序技术，检测了包虫病患者血浆棘球绦虫游离DNA并分析了其相关特征，以及探索了囊性包虫病患者在接受药物治疗前后，血浆细粒棘球绦虫游离DNA的特征变化。

图1 杂志发表文章截图

摘要

研究人员采集了23位包虫病患者的血浆，并提取游离DNA（cell-free DNA：cfDNA）进行高通量测序，每一份样本的平均测序深度为282M bp。测序数据经生信分析表明，棘球绦虫cfDNA 序列数与总的高质量序列数比率为1.8x10-5~4.0x10-9（含量极低）。囊性包虫病（cystic echinococcosis）患者棘球绦虫cfDNA片段长度范围较宽、长度分布较散，而肺泡包虫病（alveolar echinococcosis）棘球绦虫cfDNA片段长度在135 bp左右有明显的峰值。此外，研究者还发现大部分棘球绦虫cfDNA来自棘球绦虫的核基因组。血浆棘球绦虫cfDNA检测敏感性：在测序50M/200M/400M reads条件下，72.73%/90.91%/100%的囊性包虫病样本有超过80%概率检出阳性。这些特征的发现可能促进将来应用血浆中棘球绦虫cfDNA作为包虫病诊断的生物标记。

既然已经成功使用深度高通量测序鉴定了包虫病患者血浆中cfDNA的存在及特征，那么深度高通量测序也可用来监测囊性包虫病患者在药物治疗前后，血浆细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus：Eg）cfDNA特征（含量、片段长度、释放来源等）的变化。期望通过监测用药前后患者血浆Eg cfDNA变化来监测用药后疾病的发展情况。鉴于此，研究者使用高通量测序技术，首次研究了9例囊性包虫病患者在接受丙硫咪唑药物治疗前后，血浆细粒棘球绦虫（Eg）cfDNA特征变化。研究者在18份血浆样本（药物治疗前后各9份）中均检测到了Eg cfDNA，在药物治疗后，Eg cfDNA浓度、片段长度显著增加。用药前后，大部分的EgcfDNA均来源于Eg核基因组。超声检测显示4位患者囊肿大小变小，在一定程度上反映了药物治疗的效果。这些结果表明，血浆中Eg cfDNA可作为监测囊性包虫病治疗效果的潜在生物标记。

（一）

背景

包虫病是由棘球绦虫引起的最容易被忽视的热带疾病之一，全球超过100万人被感染。传统诊断方法是基于临床症状、影像、血清学测试等，但棘球绦虫感染早期常无症状（可无症状数年），因而传统方法不能对早期感染进行有效诊断，导致太晚确诊，造成遗憾的结果。血浆cfDNA (cfDNA) 由细胞外核酸片段组成，可能含有寄生虫释放的DNA。已有研究表明，通过检测血浆中cfDNA可以检测到多种寄生虫的存在。已有基于检测血浆棘球绦虫cfDNA的PCR检测方法，但由于血浆中棘球绦虫cfDNA含量极低、以及对其特征（浓度、片段长度、来源等）缺乏了解，PCR检测棘球绦虫感染的阳性率非常低（20-25%）。通过高通量测序检测包虫病患者血浆棘球绦虫cfDNA，了解血浆中棘球绦虫cfDNA特征（包括DNA浓度、长度、释放来源等），将有助于使用PCR技术对血浆中棘球绦虫cfDNA进行检测，从而诊断是否有棘球绦虫感染。

图2 棘球绦虫参考数据库构建

及棘球绦虫cfDNA鉴定分析流程

研究内容

研究者使用BGISEQ-500测序平台对23份包虫病患者血浆cfDNA进行高通量测序，产生6,480,520,054条双端序列，质控后，平均每个样本具有235M双端序列。测序结果表明，在23份样本中均检测到棘球绦虫cfDNA（阳性率100%），平均每个样本具有565条特异序列。而同时进行的ELISA测试，只有17份样本被鉴定为棘球绦虫阳性（73.9%）。对检测到的棘球绦虫进行种鉴定，22份样本大部分序列匹配细粒棘球绦虫（E. granulosus），1份样本大部分序列匹配多房棘球绦虫（E. multilocularis）。

研究者进一步研究了血浆中棘球绦虫cfDNA的浓度，结果表明棘球绦虫cfDNA 序列数与总的高质量序列数比为1.8e-5 ~ 4.0e-9，如图3。研究人员进一步计算了在不同的测序数据量下，至少有一条棘球绦虫cfDNA序列被检测到的概率，结果表明，以测序深度50M进行测序，72.73% (16/ 22)的囊性包虫病样本检测到阳性结果；以测序深度200M进行测序，90.91% (20/22)的囊性包虫病样本检测到阳性结果；以测序深度400M进行测序，100%(22/22）囊性包虫病样本检测到阳性结果。

图3 每一份样本血浆中棘球绦虫cfDNA

序列数占总高质量序列数比率

为了确定棘球绦虫cfDNA的来源，研究人员把检测到的序列与参考基因组比对，发现大部分的cfDNA来源于棘球绦虫基因组DNA（图4），少部分来源于线粒体基因组。

图4 细粒棘球绦虫cfDNA在细胞核基因组上的分布

对cfDNA序列长度分析发现，人的cfDNA长度主要为166bp左右，而棘球绦虫cfDNA长度范围更宽并且长度分布不集中，如图5。

图5 细粒棘球绦虫cfDNA片段长度分布

讨论

本研究采用极深的测序深度（平均每个样本282M reads），23份包虫病患者血浆样本均检测到棘球绦虫cfDNA（阳性率100%），极大提高了血浆cfDNA检出阳性率（PCR阳性率20-25%），说明高通量测序技术（检测血浆cfDNA）可成为诊断包虫病的有效手段。血浆cfDNA高通量测序可作为棘球绦虫血浆cfDNA研究的有效工具，高通量测序可以对人血浆中棘球绦虫cfDNA进行鉴定和定量以及特征分析，有助于促进棘球绦虫cfDNA在包虫病诊断中的应用。

（二）

背景

全球超过100万人患有囊性包虫病和肺泡包虫病，对于囊性包虫病患者，需要长期的丙硫咪唑药物治疗及定期的随访检查。随访主要通过影像检查，但细微的变化通常检测不到。其他的传统检测方法，如抗原检测、PCR检测，也因具有低的灵敏度而不适用。因此研究者想要探索更灵敏的检测方式来检测药物治疗的效果。研究者前期已经成功使用极高深度的高通量测序鉴定了包虫病患者血浆中cfDNA的存在及特征，因而使用极高深度的高通量测序也可用来监测囊性包虫病患者在药物治疗前后，血浆细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus：Eg）cfDNA特征（含量、片段长度、释放来源等）变化。期望通过监测用药前后患者血浆EgcfDNA变化来监测用药后疾病的发展情况。

研究内容

9位囊性包虫病患者在超声确诊后，均接受丙硫咪唑（400mg bid）药物治疗，药物治疗145 ± 54天(范围: 76–212天)，治疗前后均收集血浆样品（18份样本），7位患者治疗后做超声检测。超声结果表明，4位患者囊肿变小（57.14%），1位患者囊肿保持不变，2位患者囊肿变大，如图6。提取18份样本中血浆cfDNA并进行高通量测序，平均每份样本测序深度为164M reads（用药前169M，用药后159M）。测序结果表明，18份样本中均检测到Eg cfDNA，标准化的Eg cfDNA RMP（reads per million）在用药前均值是0.92，在用药后均值是6.52, 用药后Eg cfDNA RMP显著增加（Wilcoxon P < 0.01），如图6。

图 6 用药前后囊肿大小变化（A）

及血浆Eg cfDNA浓度变化（B）

研究者进一步对血浆中cfDNA片段长度进行了分析，发现，相比于人源cfDNA，Eg cfDNA片段长度分布较分散、大部分片段长度较长。与治疗前相比，药物治疗后，Eg cfDNA片段长度显著增加（中位数比较，Wilcoxon P = 0.033；平均数比较，P = 0.013），而人源cfDNA片段长度保持不变（中位数比较，Wilcoxon P = 0.15；平均数比较，P = 0.91）。见图7。

图7 用药前后，患者血浆人源cfDNA（A、C）

及Eg cfDNA（B、D）变化

为了确定Eg cfDNA的来源在药物治疗前后有无变化，研究者将Eg cfDNA序列与棘球绦虫的参考序列进行了比对，发现大部分Eg cfDNA序列仍来源于核基因组。用药前后，来源于核基因组与线粒体基因组的cfDNA所占比例没有显著变化，但在用药后，来源于核基因组（Wilcoxon P =0.011）及线粒体基因组（Wilcoxon P =0.028）的cfDNA序列数均显著增加。如表1。

表1 Eg cfDNA来源

讨论

本研究利用较深高通量测序技术，首次探索了丙硫咪唑药物治疗对Eg cfDNA的影响，以及cfDNA在监测囊性包虫病治疗情况中的潜在应用。治疗前后，Eg cfDNA浓度、片段长度的变化，暗示了Eg cfDNA具有作为治疗效果评价指示物的潜力。

参考文献：

1.Baraquin, A., Hervouet, E., Richou, C., Flori, P., Peixoto, P., Azizi, A., Delabrousse, E., Blagosklonov, O., Umhang, G., Bresson-Hadni, S., Valot, B., Grenouillet, F., & EchinoVista study group (2018). Circulating cell-free DNA in patients with alveolar echinococcosis. Molecular and biochemical parasitology, 222, 14–20.

2.Ji, J., Li, B., Li, J., Danzeng, W., Li, J., Zhao, Y., ... & Yang, D. (2020). Comprehensive characterization of plasma cell-free Echinococcus spp. DNA in echinococcosis patients using ultra-high-throughput sequencing. PLoS neglected tropical diseases, 14(4), e0008148.

3.Zhao, Y., Gongsang, Q., Ji, J., Li, J., Qi, F., Li, J., Qiangba, G., Danzeng, W., Chen, F., Zhou, H., Huasang, Yin, J., Pei, N., Xie, J., Cai, H., Asan, Pang, H., Li, J., Chen, W., & Li, B. (2021). Characterizing dynamic changes of plasma cell-free Echinococcus granulosus DNA before and after cystic echinococcosis treatment initiation. Genomics, 113(2), 576–582.

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