文献解读 | 宏基因组测序技术检测感染性葡萄膜炎病原体的初步研究

摘要

感染性葡萄膜炎是一类临床常见的眼部疾病，引起感染的病原微生物比较复杂，如何全面、快速地鉴定出每一种可能引起感染的病原微生物是诊断感染性葡萄膜炎急需解决的问题。传统病原微生物检测手段虽具有快速、简单、成本及技术要求低等特点，但无法对标本所含病原微生物做出整体分析。尤其是病毒、未知或难培养的病原微生物，目前的检测方法（涂片、培养、PCR等）均具有较大局限性，如常使用的实时荧光定量 PCR检测眼内液的病毒，只能针对已知的一种或几种病毒分别设计特异性引物和探针才能实现，同时由于玻璃体标本量较少，病毒载量较低等原因，阳性检出率很低。宏基因组测序（mNGS）可以在一次实验中识别所有潜在的病原体，对标本中可能存在的病原体进行全面检测，从而有助于疑难眼病的早期诊断。

首都医科大学附属北京同仁医院检验科鲁辛辛教授团队及眼科中心梁庆丰教授团队利用mNGS对疑诊为感染性葡萄膜炎玻璃体标本进行病原体检测，并根据实验室条件对检测到的病毒进行验证，初步探讨了mNGS在感染性葡萄膜炎诊断中的价值，并将研究结果发表于《中华眼科杂志》。在该研究中，使用了华大基因测序平台进行宏基因组测序，作者提出mNGS可作为感染性葡萄膜炎实验室诊断方法的一种选择。

对象和方法

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对象

横断面研究。

2016年3月至2018年7月首都医科大学附属北京同仁医院临床疑诊为感染性葡萄膜炎且需要进行实验室检查的19例患者。

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方法

玻璃体标本采集

19份标本均为玻璃体切除术中获得，其中800 μL玻璃体样本用于mNGS检测，200 μL样本用于实时荧光定量PCR验证。

mNGS检测

使用华大基因BGISEQ‐500测序平台进行宏基因组测序。

宏基因组测序结果主要涉及4个参数：

（1）序列数占比，指在整个标本中检测到的相同类型微生物中所占的比重；

（2）唯一序列数，指该微生物的唯一比对序列数，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关；

（3）覆盖率，指检出该微生物生物碱基数与该微生物全基因序列碱基数的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高；

（4）测序深度，是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高。

微生物 4 个测序参数值越大，表示检测到该微生物的可能性越大。致病微生物的解读依据是该物种测序所得 4 个参数数值较高，患者临床表现与测序得到的病毒、细菌和真菌结果相符。

实时荧光定量 PCR验证

根据前述4个参数对19份标本测序结果中排名第一的微生物种类进行统计，再根据4个参数数值高低、结果验证方法的可操作性、实验室预期用途以及文献病例报道等因素，选取代表性微生物采用实时荧光定量PCR做进一步验证。

结果

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mNGS结果

19份玻璃体标本检出多种微生物，测序数据根据上述4个参数结果进行综合排名，共7份标本为mNGS阳性，结果如表1所示。

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11例诊断不明患者中4例患者虽然做过相关实验室检查，但始终没有明确病原学诊断，但mNGS结果为阳性，2例为细菌（痤疮丙酸杆菌和副流感嗜血杆菌各1例），2例为真菌（均为白念珠菌）。其余8例怀疑由病毒感染引起的急性视网膜坏死（ARN）患者中3例患者标本mNGS阳性，均为水痘‐带状疱疹病毒（VZV）；5 例检测阴性，其中3例因病情紧急，患者就诊时已采用过相应治疗措施，可能对病原体检测有一定影响，其余2例检测阴性可能与病毒载量低、送检时间长有一定关系。

2

7份mNGS阳性标本中，3份VZV阳性标本的微生物总序列数分别为175万、61万、391万；2份白念珠菌阳性标本的微生物总序列数均为142万；1份痤疮丙酸杆菌和1份副流感嗜血杆菌阳性标本的微生物总序列数分别为200万、172万。 

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实时荧光定量PCR验证

3例检出VZV的标本目标基因扩增循环数值分别为34.75、30.86和32.20，说明病毒载量均较高，与测序结果一致（图1）。且相对应的 3 例患者临床症状、体征、影像学资料及治疗后反应均符合测序结果。

讨论

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高通量测序的优势在于可以同时检测临床标本中的细菌、病毒、真菌、寄生虫等，测序后可能得到几十甚至几百种微生物。检测结果可以一次性识别绝大多数潜在的病原体，从而有助于疑难眼病的早期诊断。但如何解读测序结果是临床实验室应用mNGS的关键问题，这需要大样本数据支持，要充分考虑患者临床信息与病原微生物的相关性和倾向性，综合判断才能得出结论，目前没有统一标准。

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mNGS还有需要解决的不足之处，如报告结果时间长、后续生物信息学分析复杂、操作过程及对实验室环境、人员素质要求较高等。但随着测序平台的日益普及，mNGS将为感染性眼病的诊断和治疗提供更多的帮助。

参考文献：

宏基因组测序技术检测感染性葡萄膜炎病原体的初步研究，中华眼科杂志 2020 年7 月第 56 卷第 7 期 Chin J Ophthalmol, July 2020, Vol. 56, No. 7

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