指南共识｜儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识
摘要
急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病，严重威胁儿童生命健康。快速准确的病原学诊断对于该类疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。核酸检测方法因具有较高的灵敏度和特异性，得以快速地在临床推广应用，成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。
为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用，提升病原体的诊断水平，来自儿科临床、检验、疾控及微生物学和分子生物学领域的诸多权威专家联合撰写了此次《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》，以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测，整体提升儿童呼吸道感染病原体的诊断能力。本共识于2022年3月发表在《中华实用儿科杂志》。
此次专家共识由国家儿童医学中心等19家权威单位联合推出，作为全球首个以儿童为主、涵盖全面呼吸道感染病原学诊断的应用标准，具有重要的学术引导价值。从基础理论到临床实践，从检测技术到诊疗方案均进行了深入浅出的解读，为广大儿科医生在诊疗儿童呼吸道感染患儿时提供依据和指导。
呼吸道病原体核酸检测方法
病原体核酸检测方法以是否依赖于基因组序列特征分为基因组序列依赖性和非依赖性两类方法。
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病原体基因组序列依赖性核酸检测方法
根据已知的病原体基因组序列，设计特异性引物，靶向性地进行病原体核酸扩增和检测的方法；如常规的聚合酶链反应(PCR)、等温扩增技术、核酸即时检测(POCT)技术等。
01
实时荧光定量PCR(real-time PCR)
原理：采用靶向病原体基因组的引物，通过链特异性延伸、杂交、编辑等方式实现靶向目标序列的扩增，获得可被检测到的信号，是病原体检测常用的技术方法。
优势：实现了PCR从定性到定量的飞跃，使用荧光报告分子来检测每一轮PCR扩增过程中的产物；将核酸扩增和检测步骤相结合，无需对扩增产物进行凝胶电泳；具有简单、特异性和灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等优点。
临床应用：常用于呼吸道病毒、肠道病毒、脑炎病毒、肝炎病毒、HIV、结核等病原体诊断。
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等温扩增技术
优势：该技术具有操作简单、快速、高效、特异、无需专用设备的优点，较适用于基层和现场检测。
技术分类：代表性技术有环介导等温扩增(LAMP)和核酸序列依赖性扩增(NASBA)。
临床应用：等温扩增技术扩增体系的稳定性和方法的成熟度不及传统PCR方法。LAMP技术对引物设计要求高，对扩增靶序列的长度有限制，一般不能进行长片段的扩增。NASBA适用于RNA病毒的检测，可检测常见呼吸道病毒和流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌，用于辅助诊断。但NASBA技术反应体系和组分相对复杂，需要多种酶反应，增加了检测成本。
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核酸即时检测(POCT)技术
优势：POCT具有快速、自动、整合从细胞裂解、核酸提取扩增到产物分析的全部测定步骤，降低检测复杂性，有效防止交叉污染等优点，是病原学检测最受关注的发展方向。
临床应用：最为成熟的呼吸道感染病原临床检测包括针对耐药型结核杆菌，甲/乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的多联检测体系;新冠疫情推动了病原体核酸POCT的快速发展，SARS-CoV-2被迅速列入各POCT联合检测体系中；高质量国产核酸POCT的临床推广应用和前景目前分子诊断领域发展的热点。
华大基因PM Easy Lab 全自动核酸检测系统，真正实现提取-扩增-报告一体化，“样本进，结果出”；配套的呼吸道病原体核酸多重检测试剂盒可一次性检测包括细菌、病毒、支原体/衣原体共计18种常见呼吸道病原体。
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病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法
不需要根据病原体基因组序列设计特异性引物，而是对样本中的病原体序列进行高通量测序，将获得的序列与数据库中序列进行比对分析而确定病原体的方法，如mNGS。
mNGS原理：利用宏基因组技术对感染部位样本中提取的核酸进行高通量测序，经过专用数据库比对和智能化算法分析，一次性无偏性地检测样本中包含的细菌、病毒、真菌和寄生虫等上万种病原微生物。
优势：mNGS不依赖特异性的引物扩增，无需预先假设、无需培养、无偏倚性、适用于各种临床样本；在呼吸道感染的病原体检测和研究中，具有较其他分子检测技术不可比拟的优势。
临床应用：对于儿童呼吸道感染，在病因不明且病情危重需要尽快明确病原体、疑似新发或特殊病原体感染、传统微生物检测技术多次阴性且治疗效果不佳等情况下，可以在常规病原检测的同时或在其基础上对样本进行mNGS分析，以高效获取感染病原体的信息。
mNGS在临床应用的挑战：
(1) 基于mNGS方法的实验操作步骤多且较复杂，有一定技术难度；
(2) 宿主或环境噪音信号较多，检测结果容易受到人源宿主及环境物种遗传物质的干扰，影响有效病原体数据的获取；
(3) mNGS技术检测样本中的核酸（包括DNA与RNA），无法完全区分检测到的微生物是否为感染病原体，结果的解释需结合临床综合判断；
(4) 报告解读复杂，下机数据的分析及结果报告应由临床专业人员结合患儿临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果综合判断其临床意义；
(5) mNGS方法的质量控制和标准化评价方法有待完善。
呼吸道病原体核酸检测推荐人群
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门诊患儿
(1) 急性上呼吸道感染患儿，一般不常规进行呼吸道病原体的核酸检测，但对于有特异性抗病毒药物的病毒感染，如流感病毒，可视条件或在其他检测方法不能明确诊断时，使用核酸检测，有利于抗病毒药物的合理应用。
(2) 急性下呼吸道感染患儿，或有心肺等重要脏器的基础疾病、免疫功能异常的急性呼吸道感染患儿，建议根据患儿年龄、临床特征和发病季节等及时选用可疑病原的核酸检测方法进行病原学确定，尽快明确病原体，有助于患儿治疗方案的确定和后续管理。
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急诊及住院患儿
(1) 对有急诊适应证及所有因急性呼吸道感染性疾病住院、住院期间新出现呼吸道感染症状（伴或不伴发热）、或出现不明原因的呼吸窘迫、慢性心肺疾病急性恶化、血液病、肿瘤患儿出现中性粒细胞减少/缺乏伴发热的，应根据年龄、临床特征和发病季节等，推荐选择核酸检测方法进行病原学诊断，为鉴别诊断需要可采用多重核酸检测。
(2) 有急性呼吸道感染的危重症患儿，建议首选多重核酸检测。若常规核酸检测不能明确病原，推荐采用mNGS进行病原学检测，但其结果需要结合临床表现综合分析，必要时使用其他方法进一步验证。
呼吸道病原体核酸检测的标本类型及选择
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适宜标本类型
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上呼吸道标本
主要有鼻拭子(NS)、口咽拭子(OPS)、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽吸取物(NPA)、鼻腔洗液(NW)和咽洗液等。新冠流行以来，上呼吸道各种标本的组合也得到了验证，使用口咽拭子和前鼻孔取样的配对采集被证明与鼻咽拭子采集的效能相当。唾液和咽喉漱口水等非侵入性方法易于采集，并可用于大规模人群监测。
02
下呼吸道标本
主要为痰、气管吸取物、支气管镜检查获得的标本，包括肺泡灌洗液(BALF)和保护性毛刷标本等。
03
其他标本
血液、胸腔积液、组织或局灶穿刺物等标本也可应用病原体核酸扩增检测(NAAT)。
2
不同病原体检测的标本类型选择
01
病毒
上、下呼吸道标本及血液、胸腔积液等标本均可用来行病毒NAAT。
02
细菌
(1) 上呼吸道标本通常不推荐用于细菌NAAT；
(2) 诱导痰、气管吸取物和BALF等下呼吸道标本及无菌体液或组织标本是进行细菌NAAT的适宜标本。
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非典型病原体
上、下呼吸道标本均适宜于肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌的NAAT，但下呼吸道标本的结果更具病原学诊断价值。
04
真菌
怀疑下呼吸道真菌感染时，建议采集BALF、无菌体液或组织标本进行真菌NAAT；怀疑真菌性鼻窦炎时可酌情采集鼻窦分泌物和组织标本。
各种标本采集及转运方法见表1，参照美国传染病学会和美国微生物学会2018年更新的“用于传染病诊断的微生物实验室使用指南”修订，供临床医师参考。
（表1）
呼吸道病原体核酸检测结果解读
及注意事项
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常规核酸检测
常规核酸检测是序列依赖的核酸检测，只能扩增特异性引物所覆盖的核酸序列。随着多重核酸检测方法越来越多的使用，同一份标本中可能会同时检测出多种病原体，提示存在混合感染。临床医师需要结合不同病原体的季节流行特征、生物学特性和致病特点，核酸检测结果提示的病原体相对载量高低，患儿临床特征等进行综合分析，以明确哪一种病原体是主要病原体。
01
核酸检测阳性
上、下呼吸道标本的病原体核酸阳性结果在病毒、细菌、非典型病原体及真菌感染中的诊断价值有差别。若核酸检测阳性结果与临床表现严重不符，要注意是否有引物的特异性差和实验室污染等方面的问题，另外，痰液也有被上呼吸道病原污染的可能，临床医师需及时与实验室方面沟通。
病毒：急性期上或下呼吸道标本检测阳性，可提供病原学参考。由于部分病毒存在较高的无症状感染率，故上呼吸道标本的阳性结果要结合临床综合考虑，下呼吸道标本的病原学诊断价值更大。
细菌：下呼吸道标本、血液等无菌体液标本核酸阳性检测结果具有诊断价值；百日咳鲍特菌主要感染鼻咽部，上呼吸道标本检测阳性具有诊断意义。
非典型病原体：上、下呼吸道标本核酸检测阳性，多数情况下对肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌等非典型病原体具有诊断价值，但下呼吸道标本结果更具有病原学价值。
真菌：下呼吸道标本、无菌体液、器官组织、鼻窦分泌物等标本真菌检测阳性结果，具有诊断价值。
02
核酸检测阴性
(1) 结合患儿临床表现除外某种病原体感染。
(2) 若临床高度提示某种病原体感染，但核酸检测阴性，要考虑标本是否合格、病原体可能存在变异、试剂的检测阈值和质量以及实验室检测等方面的问题，临床医师要及时与实验室反馈和沟通。
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mNGS
随着mNGS技术在临床上的不断推广，国内临床和检验领域发布了一系列专家共识，对mNGS中存在的某些共性问题，尤其是结果报告和解读提出建议。
01
报告内容
(1) 报告病原体列表：建议按照细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体类型以及临床关注程度分类呈现，便于快速锁定目标病原；病原体信息应准确到种信息，同时应包含相应的属信息。
(2) 报告参数：建议至少列出但不限于如下报告参数：检出序列数(reads数)、基因组覆盖度、鉴定置信度、相对丰度等。
reads数指的是测序获得的碱基序列的数量，检测报告中常列出某微生物种属名下的序列数，即匹配到该病原体的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量、人源序列比例有关；
基因组覆盖度是表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高；
鉴定置信度是根据序列比对数、基因组大小和基因组保守性，判断样本中存在该微生物的可信度；
相对丰度是指按照细菌、真菌、病毒和寄生虫进行分类，结合基因组大小，计算出该病原体在相应分类中的相对比例。
02
报告解读
由于呼吸道中广泛存在定植微生物，为提高解读准确性，在mNGS检出序列数和覆盖度的基础上，应结合采集样本类型、采样位置、患儿的临床特征、基于传统技术检测的病原体和辅助检查报告，综合判断致病菌、定植菌和背景菌。报告解读中尤其需要重点关注以下几个方面。
(1) 样本质量：对结果正确的解读首先要建立在合格样本的基础上。采集的样本应是感染部位的体液或组织，并严格执行样本采集的无菌流程。污染防控对样本结果的质量控制至关重要。
(2) 对照质控：每批次实验中均应设立内参照、阴性对照品和阳性对照品。阴性对照或内参用于提示流程是否存在异常，有助于判断样本结果的假阳性。
(3) 检出阈值：在实践应用中，由于mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患儿状况等，目前尚无统一共识性或标准的检出阈值。
(4) 基于基因序列数量的解读：
a) 根据测序原理，病原体的基因序列数越多,相对丰度越高，表示样本中检测到该病原体的可信度就越高。样本中某一种微生物检出的reads数越多，其为致病病原体的可能性越大。
b) 但不同病原微生物的基因组差异较大(寄生虫>真菌>细菌>病毒)，核酸提取效率存在差异，因此不能仅依靠reads数多少来判断是否感染，需同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。
c) 对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、真菌等，即使在检测报告中reads数较低，也要考虑其为致病微生物的可能性，应采用其他方法开展验证，如特异引物的PCR、产物测序验证和血清学试验等。
d) 此外，如发现特殊罕见的病原体，即使其reads数很少，也应予以关注，建议开展验证。
(5) 基于临床表征符合度的解读：
a) 若mNGS测序结果符合患儿的临床表现和其他实验室检查，推荐根据测序结果指导临床决策；
b) 若缺乏除mNGS测序结果外的其他实验室支持证据，应采用PCR技术对mNGS所检出病原进行复核，建议临床进一步开展传统实验室检查进行验证；
c) 若临床表现或实验室检查结果不支持mNGS结果，则不能仅根据mNGS测序结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床诊断参考依据。同时也需考虑方法学不一致导致的差异及样本类型和送检时间的影响。
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核酸检测结果对临床用药指导价值
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抗呼吸道病毒药物的应用原则
参考病原学结果，结合临床及流行病学资料谨慎选择抗病毒药物。目前特异性抗呼吸道病毒的药物不多，只有流感病毒、疱疹病毒等有明确的针对性药物。儿科医师应尽量明确病毒感染的病原学，严格掌握抗病毒药物的适应证，根据患儿病情轻重及药物本身理化性质，按照5R原则(正确的患者、正确的时间、正确的药物、正确的剂量及正确的给药途径)进行抗病毒治疗。
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核酸检测阳性患儿，抗菌药物的应用和选择原则
(1) 在儿童呼吸道感染中，各种细菌、真菌、支原体和衣原体等的核酸阳性结果需要临床综合评估。
若考虑为致病病原体，具体抗菌药物需根据当地耐药监测数据和可及性进行选择。
有些病原已经可以通过核酸检测耐药基因/耐药突变的存在，如耐青霉素肺炎链球菌、碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌、耐大环内酯的肺炎支原体/百日咳鲍特菌、耐利福平的结核分枝杆菌等，这些结果对抗菌药物的选择有较好的参考意义，同时也要充分考虑患儿对治疗的实际反应。
(2) 当病毒核酸检测阳性时，如果患儿出现重症的早期征象、早期抗病毒治疗临床好转后病情再次恶化或应用抗病毒治疗3-5d仍无好转，应该经验性治疗可能合并的细菌感染，并在治疗的同时行进一步检查。
附录A
儿童呼吸道感染病原学
1.常见呼吸道病毒及新发再发病毒
病毒是儿童呼吸道感染的主要病原体，包括常见呼吸道病毒及新发再发病毒，儿童呼吸道感染病毒种类至少涉及7个病毒科共200多个型别的病毒。包括人呼吸道合胞病毒、人流感病毒、人副流感病毒、人鼻病毒、人腺病毒、人偏肺病毒、人冠状病毒(含普通HCoV和高致病性冠状病毒)、人博卡病毒、人肠道病毒等。
2.常见细菌
引起儿童呼吸道感染的常见细菌有A族链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、百日咳鲍特菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌等。
3.非典型病原体
儿童呼吸道感染的非典型病原体主要包括肺炎支原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体及嗜肺军团菌。
4.主要真菌
目前儿童呼吸道真菌感染的常见种类为假丝酵母菌属、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、球孢子菌属、曲霉菌和新型隐球菌等。
病原体感染病原学，略
附录B 核酸检测常用名称术语，略
参考文献：
谢正德,邓继岿,任丽丽,等.儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识[J].中华实用儿科杂志. 2022,37(5):321-332. DOI: 10.3760/cma.j.cn101070-20211222-01490.
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