前沿文献 | mNGS技术在儿童侵袭性肺炎链球菌病中的应用价值
引言
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)通常存在于人类鼻咽部，是一种非常重要的侵袭性呼吸道感染病原体，对世界各地儿童构成严重威胁。由肺炎链球菌引起的无菌部位感染，包括菌血症、败血症、细菌性脑膜炎、骨髓炎、胸膜炎等，统称为侵袭性肺炎球菌病(Invasive pneumococcal disease， IPD)。然而儿童IPD感染的早期阶段难以识别，导致患儿住院时间延长、抗生素耐药和医疗费用增加。因此，早期识别和靶向抗感染治疗是改善IPD患儿预后的关键。目前肺炎链球菌的鉴定主要还是依靠培养和核酸检测等传统诊断技术，阳性率较低，耗时较长。宏基因组二代测序技术(mNGS)作为一种新型无偏性检测方法，一次性可检测上万种病原体，应用于IPD患儿的报道还较少。
2021年12月河北省儿童医院研究团队在《Transl Pediatr》(IF：2.488)期刊发表了一篇单中心回顾性分析，探讨在侵袭性肺炎链球菌病(IPD)儿童的血液、脑脊液和胸腔积液样本中，mNGS的敏感性和特异性，以及检测时间对患者预后和成本的影响。研究发现：mNGS对血液、脑脊液和胸腔积液样本中肺炎链球菌的检测敏感性和特异性均较高，且肺炎链球菌的序列数与发病至标本采集的时间间隔有一定相关性。早期mNGS检测对IPD儿童30天生存率没有显著影响，但可以降低住院费用和住院时间。
研究方法
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入组
对2017年1月1日至2021年3月1日期间河北省儿童医院收治的IPD患儿进行回顾性分析。
入组标准
肺炎链球菌可以从正常无菌部位分离(血液、脑脊液、胸膜渗出液)的患儿
除外感染
非IPD感染的；
病例不完整的；
未接受mNGS检测的。
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分组
根据临床症状和病变分为3组
第1组：菌血症，血液样本；
第2组：脑膜炎，脑脊液样本；
第3组：胸膜炎，胸膜渗出液和深痰样本。
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检测方法
所有的样本均进行mNGS、培养和抗原检测。
一部分mNGS检测与传统方法同步进行(病发7天之内)，另一部分mNGS检测在常规检测阴性或者抗感染治疗失败一周后进行(治疗7天之后)。
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mNGS检测和数据分析
所有受检者的样本都送往华大基因进行PMseq病原微生物高通量基因检测。样本均符合mNGS检测要求及储存要求，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000平台测序。测序结果去除低质量的和长度小于35bp的数据以获得高质量数据。通过BWA比对将人源核酸序列的数据去除。剩余数据在去除低复杂度序列后与专用的PMBD微生物数据库比对，测序后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。
以Alere BinaxNow®肺炎链球菌(S. pneumoniae)抗原检测和血培养为金标准，采用受试者工作特征(ROC)曲线建立mNGS的诊断价值。
研究结果
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本研究共纳入96例病例，包括第1组(菌血症，n=65)、第2组(脑膜炎，n=17)和第3组(胸膜炎，n=14)(图1)。
（图1.研究流程图）
检测性能
mNGS检测阳性率为62.5%(n=60)，总符合率为75.0%；培养法检测阳性率为27.1% (n=26)(表1)。比传统的培养法相比，mNGS对鉴定肺炎链球菌具有更高的敏感性和特异性，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表1. 病原体检测结果比较
(注：PPV：阳性预测值，NPV：阴性预测值，DCR：总符合率)
检测时间对种特异性序列的影响
对IPD儿童不同mNGS检测时机的肺炎链球菌检出特异性序列比较发现，样本采集的时间越早，检出序列数更多，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。
表2. 肺炎链球菌不同mNGS检测时间检出序列数对比
检测时间对预后的影响
早期mNGS检测对IPD儿童30天存活率没有显著影响(表3，图2)。但是发病7天后进行mNGS检测有4例患儿产生了严重的并发症，但是发病7天内进行mGNS检测的却没有并发症出现，并且早期mNGS检测可显著降低住院天数和费用(P<0.05)(表4)。
▲ 表3. mNGS不同检测时间的患儿30天生存率
▲ 图2. mNGS阳性组和阴性组生存曲线
▲ 表4. 不同检测时间的住院天数和费用比较
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结果讨论
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1. 与传统检测方法比较，mNGS技术对IPD儿童的血液、脑脊液、胸腔积液样本的肺炎链球菌检测拥有较高的敏感性和特异性，原因如下：
· 肺炎链球菌不仅是传统的胞外菌，还可以在宿主细胞的液泡中存活，避免了酸性溶酶体的降解，从而可以调节毒力基因的表达，继而影响传统培养法的结果；
· 抗生素可以破坏病原微生物，但是它的DNA却可以在血浆中游离很久，而宏基因组测序技术是针对的病原微生物的DNA片段而不是微生物本身，因此受抗生素影响较小；
因此，如果将传统培养法和mNGS检测的结果相结合，检测敏感性和特异性会更准确。
2. 肺炎链球菌的检出序列数随着抗生素的使用和疾病的改善而减少。7天内检测到的序列数显著高于发病后7天以上的，表明mNGS检测到的肺炎链球菌序列数与样本采集的时间有关。越早进行mNGS检测，阳性结果的可能性越大。
3. 对于三种不同的体液样本，肺炎链球菌的最适检出序列数不同。因为对于mNGS来说对某一种病原微生物的鉴定并没有统一的标准，而且不同样本类型的DNA提取方法以及人源含量也是不一样的。
4. mNGS的延时检测没有显著提高IPD患儿的存活率，该研究显示增加了医疗花费和住院时间。且延时检测使患儿更易发生严重并发症。
结 论
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1. 本研究首次对儿童侵袭性肺炎链球菌病的mNGS检测价值进行评估。相对于传统方法，mNGS对于肺炎链球菌的检出具有明显优势：
· 针对血液、脑脊液、胸膜渗出液样本，mNGS对肺炎链球菌的检出具有较高的敏感性和特异性；
· mNGS受抗生素及宿主细胞表达影响较小；
· mNGS可以用于多种病原微生物混合感染的诊断。
2. 肺炎链球菌检出序列数与采样时间相关，延时采样会导致检出序列数的下降。虽早期进行mNGS检测对IPD儿童30天生存率没有显着影响，但可以降低住院费用和住院时间。
参考文献：
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