圣诞重磅开售 | 让碱基识别更清晰——CoolMPS高通量测序试剂套装
华大智造在2019年国际基因组学大会上重磅发布的“CoolMPS高通量测序试剂套装”开创性地推出了用抗体进行测序的试剂产品。这一创新可以实现无损碱基识别，能够让碱基识别更为清晰。这一测序试剂套装也即将于圣诞节正式开售。
那么，它的诞生将带来哪些独具一格的优势？它的数据表现如何？
优势特点：信号强、天然、效率高
信号强、天然及效率高可以概括地反映CoolMPS高通量测序试剂盒的特点及优势：
首先，它信号强，每个抗体能标记多个荧光，碱基信号更强，相同拷贝数的DNB用CoolMPS可以获得更高的信号和更高的信噪比，从而使测序更准确。图1显示了在多个循环中使用两种测序化学的信号强度比较，CoolMPS产品信号强度远高于传统高通量测序试剂产品。
图1 测序时CoolMPS的信号强度及随循环数的变化趋势
其次，它没有非天然碱基带来的荧光淬灭，因为荧光分子标记在抗体上，测序过程中无多余化学键的残留,所以准确性更高。在传统的高通量测序方法中，聚合的碱基上会留下多余的化学键，即“疤痕”（图2），这可能会影响待测碱基上的荧光信号，进而影响测序的准确性。CoolMPS方法中新合成链的碱基为天然碱基，不会因为碱基上的疤痕而影响荧光信号，最终获得更高的准确性和更长的测序读长。
图2 CoolMPS与传统高通量测序方法的比较：无疤痕
图3展示了CoolMPS测序中，前两个碱基对被测碱基信号的影响。碱基上不存在任何“疤痕”，不论前面两个碱基是什么，其A、C、G、T的信号均相当稳定。
图3 CoolMPS测序中，前两个碱基对被测碱基信号的影响
图4展示了CoolMPS的测序错误类型与前一个碱基的关系：无论前两个碱基是什么，CoolMPS的测序错误都非常低，且没有明显的错误偏好。
图4 CoolMPS前两个碱基对被测碱基错误类型的影响
再者，它的反应更完全，即DNA聚合天然碱基的效率更高，测序读长更长。聚合酶结合及新加的都是天然碱基，DNA聚合酶在生物体内的底物是天然dNTPs。虽然经过突变体的改造，DNA聚合酶也能加碱基上有庞大荧光基团标记的dNTPs，但其反应效率远远不如加碱基上没有标记的dNTPs。此外每一轮反应接近100%的完成率也是进行长读长测序的必要条件，否则信号会呈现指数下降，产生测序错误。
测序时，常用lag及runon指标来反映反应是否完全。lag是指测序进行到N位置时，其某些拷贝才反应到N-1位置的比例；而runon则指某些拷贝已反应到N+1位置上的比例。我们测定了用于CoolMPS的测序酶在加100%的有荧光标记碱基的dNTPs与加无修饰碱基的cold dNTPs的lag与runon，其结果如图5所示，加cold dNTPs的平均lag值（0.2%）比加荧光标记dNTPs的平均lag值（0.7%）低很多。同时，加cold dNTPs的平均runon值（0.06%）比加荧光标记dNTPs的平均Runon值（0.24%）低很多。CoolMPS技术的低lag及低runon可能使得测序读长更长。
图5 DNA聚合酶对Cold dNTP与Labeled dNTPs的聚合的lag和runon的效率比较
应用数据展示
01 | CoolMPS PE100测序数据产量及Q30表现优异 |
CoolMPS与StandardMPS的PE100测序在WGS(PCR)、WGS(PCR-Free)、WES、RNA-Seq和Panel等应用上的数据显示：CoolMPS的数据产量比StandardMPS高6%，且Q30%比StandardMPS高1~9%。
图6 CoolMPS PE100数据产量和数据质量表现（Demo数据）
02 | 应用数据表现：肿瘤Panel、RNA-Seq |
针对两种不同的应用数据，结果显示CoolMPS测序数据的clean rate和mapping rate表现良好，且覆盖度均一；CoolMPS检测频率准确，且与理论频率的相关性更高。
肿瘤Panel
样本：FFPE标准品Horizon HD200
测序平台：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)
测序读长：PE100
测序试剂：CoolMPS & StandardMPS
测序结果：
CoolMPS与StandardMPS检测频率均准确，CoolMPS检测与理论频率的相关性更高。
表1 CoolMPS与StandardMPS的肿瘤数据比较
图7-1 StandardMPS与理论的突变检测频率的的相关性
图7-2 CoolMPS与理论的突变检测频率的的相关性
RNA-Seq
样本：UHRR标准品
建库：MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装
测序平台：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)
测序读长：PE100
测序试剂：CoolMPS & StandardMPS
表2 CoolMPS与StandardMPS的RNA-Seq数据比较
图8 CoolMPS，StandardMPS及N 平台与qPCR的相关性，Spearman r=0.866，高度一致。
图9 CoolMPS，StandardMPS及N平台的相关性
不同方法或相同方法测序重复性均大于0.99
CoolMPS的测序原理
大家也许对CoolMPS的测序原理依然充满好奇，它实质上可以理解为现有测序试剂（StandardMPS）的升级版，它使用的核苷酸是碱基上未标记荧光的dNTPs（cold dNTPs）。在DNA聚合酶的作用下，cold dNTPs被聚合到测序链，然后通过和与此cold dNTPs特异结合的荧光标记的抗体（图10）来实现碱基识别。再生后，抗体从测序链上掉落，测序链上新加入的碱基完全是天然的碱基，没有任何修饰，如此循环往复，完成对DNA的测序（图11）。
图10 CoolMPS测序原理
图11 CoolMPS测序时，抗体分子与碱基的结合
拥有如此多优点的CoolMPS 高通量测序试剂套装将于今年圣诞节12月25日正式开售，欢迎您一同探索它的奇妙与不凡！