十亿级通量的核酸蛋白互作平台发布！华大智造基因测序平台助力基础科研！
DNA和蛋白质是生物中两个最重要的生物大分子，它们之间的相互作用在细胞的生命活动中起着至关重要的作用。那么，它们之间相互作用是如何进行的呢？相互作用所涉及的结合或者切割所需的特定靶向位点（Motif）会是什么序列？研究人员又是通过哪些技术来探测的？由于基因组中98%的序列是非蛋白编码区，高通量大规模地来寻找所有可能的蛋白靶向位点是技术发展的必然趋势。
2020年7月31日，国际著名期刊Science Advances杂志在线发表了深圳华大生命科学研究院撰写的题为“DNB-based on-chip motif finding (DocMF): A high-throughput method to profile different types of protein-DNA interactions”（DocMF: 一种基于DNA纳米球技术的在芯片上高通量鉴定不同蛋白-DNA互作位点的平台）的研究论文。
Science Advances网站截图
这是一个以DNA纳米球（DNBSEQTM）技术为基础的，使用高通量测序芯片来分析蛋白质-DNA相互作用的高灵敏度、高通量的鉴定平台（简称DocMF）。使用该系统，研究团队成功地鉴定了常用核酸内切酶的识别位点（restriction sites），以及CRISPR/Cas蛋白特异性识别所需的PAM序列。
目前研究蛋白质与DNA相互作用的靶向序列的方法有很多，常用的有微阵列技术（PBM：Protein-Binding Microarray）或者SELEX，但是这些方法通常费时费力且通量不够高。与这些技术相比，DocMF除了能检测出更多的蛋白和DNA结合位点，还能在DNA分子被蛋白切割后，大规模地提供有关与蛋白质相互作用的Motif信息。因此，DocMF是目前第一个能够同时鉴定蛋白切割位点以及蛋白与DNA靶向结合位点的高通量平台。
DocMF利用华大智造独有的DNBSEQTM测序技术和两次成像拍照结合的方法来检测蛋白质-DNA相互作用中所涉及的切割或者结合所需的特异性靶向序列。从单个DNB的序列信息和荧光信号变化，我们可以找到与蛋白质发生相互作用的所有序列，并通过生物信息学分析确定特定的靶向序列。测序芯片的通量可以允许一次性筛选十亿级别、带着不同序列的DNA纳米球，大大高于PBM或者SELEX的通量，DocMF能够很灵敏地找到弱结合力的所有互作位点序列。
DocMF流程示意图
运用DocMF方法，研究人员首先鉴定了不同类型的限制性内切核酸酶以及CRISPR/Cas的识别位点。最新基因编辑工具CRISPR/Cas系统是存在于多数细菌和古菌中的一种后天免疫系统，经生物学家改造后，可高效、便捷地实现基因定点修饰。此类Cas系统包含三个核心元件-Cas核酸酶，引导RNA（gRNA），间隔序列前体临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对Cas蛋白特异性识别靶序列至关重要,也是CRISPR/Cas系统发挥功效的关键特性之一。目前，现有的技术（E.coli双抗实验，Cas核酸酶切后高通量测序等），对PAM序列的鉴定仍存在不同的缺陷，如耗时长、灵敏度低等。利用DocMF，研究人员发现SpCas9除了经典的5’-NGG-3’的PAM外，还有两个较为少见的5’-NAG-3’和5’-NGA-3’的PAM序列，并且算出NAG出现几率在5%左右，而更弱结合力的NGA只有1.6%。
文章还探索了两个未发表的新型CRSIPR/Cas蛋白，VeCas9和BvCas12a。其中VeCas9的PAM序列用传统的E.coli双抗实验方法无法准确鉴定出。利用DocMF，这两个新型CRISPR/Cas蛋白的宽松PAM序列也均能被准确检出。同时研究人员还能根据芯片上信号变化比值，对不同PAM序列的活性排序，找出结合力最强的PAM序列，有助于设计体内基因编辑的最佳靶向位点。同时文章作者也讨论说明DocMF还可以被用来寻找Cas蛋白的脱靶序列。因此，DocMF为新型基因编辑系统的研究提供了一个强有力的工具，将会更快地推进更多新型编辑系统的发现及其功能研究。
经DocMF鉴定出的VeCas9和BvCpf1的PAM序列
为研究蛋白与DNA结合靶向位点的鉴定，团队选用无切割活性的dCas9进行测试，筛选出NGG序列为dCas9的PAM特异性位点，该特异性NGG序列是与以前的报道一致的。同时研究人员也发现，由于蛋白上两个氨基酸的突变，导致dCas9无法像传统的Cas9一样对NAG和NGA序列进行靶向结合。
DocMF平台鉴定的dCas9结合位点
综上，DocMF平台基于华大智造测序仪，提供了一种检测多种蛋白质-DNA互作靶向位点的高通量的方法。整个鉴定流程耗时约三天，包括文库的制备、测序及分析，极大地缩减了工作时间及工作量。由于其高深度和高通量，也极大地提高了检测的准确性。
文章通讯作者之一、华大研究院院长徐讯表示，DocMF不只是全球唯一的能兼容鉴定蛋白与DNA结合或切割靶向位点的高通量平台，也具有鉴定CRISPR系统脱靶位点、转录因子结合位点的潜力。DocMF平台的开发，为后续蛋白质-DNA互作的研究提供了一个强有力的工具，同时此研究也扩展了以DNA纳米球为基础的测序技术的应用范围，体现了国产化基因测序平台研究工具的优势。
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