首创无DNA损伤插入长序列片段，斯坦福丛乐团队开发出高精度千碱基规模基因编辑工具，即将开展临床前试验丨专访
“基因魔剪” CRISPR/Cas9 是本世纪迄今为止最为重要的发现之一，经过多年的发展和优化，目前已经从基础科研走向了临床应用中。“全球基因编辑三巨头” CRISPR Therapeutics、Editas Medicine 和 Intellia Therapeutics 的基因编辑疗法均已进入临床试验阶段。
一方面，CRISPR/Cas9 技术为遗传性难治疾病带来了一次性治愈的希望；另一方面，现有的 CRISPR 技术还面临着安全性、高脱靶率和长序列修复等难题，基因编辑工具仍需要不断迭代更新。
2 月 10 日，斯坦福大学医学院丛乐教授课题组将一种微生物的 DNA 精确重组酶单链退火蛋白（SSAP）与无损伤结合 DNA 的 dCas9 系统相结合，开发出新型基因编辑工具 dCas9-SSAP。该工具在人类细胞中完成了无任何 DNA 断裂的长序列精准编辑，且成功实现上千个碱基的无脱靶长基因序列插入。团队还探索了这一工具在干细胞中的应用潜力。
（来源：Nature Cell Biology ）
相关最新论文发表于 Nature Cell Biology 上，丛乐为本研究的通讯作者，第一作者是丛乐实验室的 Chengkun Wang（王成坤）博士。他于 2018 年加入丛乐实验室，这项研究也是其在 SSAP 上近四年探索研究的积累。
“与 CRISPR/Cas9 相比，常用于表观基因编辑的 dCas9 系统并不会造成基因断裂、损伤以及脱靶等问题。我们的工具将没有 DNA 切割活性的 dCas9 与经过改造优化的 SSAP 结合在一起，兼具表观遗传基因编辑的安全性与基因组编辑工具的持久性。同时，在人类细胞中达到了两位数的编辑效率，这真是一个令人意外且欣喜的结果。” 丛乐告诉生辉。
图 | 斯坦福大学医学院助理教授丛乐课题组，左一为丛乐博士，右一为王成坤博士（来源：受访者提供）
丛乐本人拥有多学科交叉科研背景，现在是斯坦福大学医学院病理与遗传学系助理教授、霍华德休斯医学院国际研究员。他曾先后就读于清华大学电子系和生物系，博士曾师从基因编辑先驱人物、MIT 创业科学家张锋， 他是张锋实验室的第一个博士生，也是应用于真核细胞中 CRISPR 技术的共同发明人。博士后在计算生物领域大牛、人类细胞图谱最重要的领导者 Aviv Regev（现为罗氏全球临床前研发负责人）实验室从事癌症基因组学和单细胞计算生物学研究。两位老师对丛乐的科研和转化工作也产生了深刻的影响。
今年是丛乐在斯坦福医学院成立实验室的第 4 个年头，其实验室的核心思想是开发新一代基因和细胞治疗技术。在这一思路下，实验室的核心研究可以总结为三大方向，一是开发新型基因编辑工具，二是单细胞基因组学分析，利用单细胞多组学技术分析如何改造基因和细胞，三是为生物学研究引入机器学习、人工智能技术等多学科技术。
无任何 DNA 损伤插入长片段，精确度超 99%
沿袭了在博士期间的研究工作，丛乐实验室的第一大研究方向是开发 “新一代” 基因编辑工具。与人类复杂的 DNA 重组机制不同，微生物中 DNA 的损伤修复更为简洁， 只涉及几种酶的参与。因此，他们一直尝试在微生物中寻找新的编辑蛋白，简化 DNA 损伤修复流程，其中 SSAP 是该实验室研究最为深入的一种编辑蛋白。
这是一种微生物 DNA 精确重组酶，丛乐课题组发现噬菌体可以通过使用 SSAP 蛋白完成上千个碱基（1000bp）的精确插入，且这一过程并不需要 DNA 双链切割。截止目前，SSAP 蛋白的结构和功能的具体细节尚不清楚，此前的阐释这种蛋白功能的研究也主要集中在微生物和细菌中。在本次研究中，丛乐课题组和普林斯顿大学的王梦迪课题组（论文共同作者）利用 AlphaFold2 和自主开发的 AI 工具预测了 SSAP 蛋白质结构及其与 DNA 的结合模型 。
自 2018 年加入丛乐实验室以来，王成坤一直在挖掘 SSAP 蛋白在基因编辑中的应用潜力。2021 年，他们首次将 Cas9 和 SSAP 结合应用于人体细胞编辑，其中 Cas9 在基因组中引入 DNA 双链断裂，SSAP 能够在 DNA 双链断裂情况下促进基因精准插入。相关研究发表在 Nucleic Acids Research 上。
基于 2021 年的研究进展，从现有 CRISPR 技术在临床中面临的安全性和长片段序列两大难题出发，丛乐课题组提出了一种不同于 CRISPR/Cas9 的新型基因编辑器 dCas9-SSAP。在研究中，他们选择了没有 DNA 切割活性的 dCas9，dCas9 会在向导 RNA 的帮助下结合到特定的基因组位点，然后在这个基因组位点打开 DNA 双链。然后经优化的 SSAP 蛋白会结合到打开的 DNA 双链中，并直接插入长片段 DNA 序列。（dCas9 是一种突变的 Cas9 酶，其保留了 Cas9 与 DNA 结合的能力但不会切割 DNA 双链）。
图 | 无 DNA 损伤的 dCas9-SSAP 基因编辑器（来源：上述论文）
有点类似于噬菌体的 DNA 序列重组，dCas9-SSAP 无需剪切 DNA 片段即可插入上千碱基的超长基因片段。
“dCas9-SSAP 兼具表观编辑工具的安全性和基因组编辑工具的持久性，并在这两个层面实现了意想不到的结合和突破。总体而言，dCas9-SSAP 基因编辑工具能够在不引入 DNA 双链断裂的前提下进行高效、安全、精准的长片段外源 DNA 的插入，从而第一次揭示了无切割基因编辑工具的可行性和应用潜力。” 丛乐总结道。
值得注意的是，dCas9-SSAP 的基因编辑原理和传统依赖 DNA 切割的 Cas9 工具大不相同，其专利有潜力成为独立于 Cas9 等一系列现存基因编辑专利的 “元 IP”。
在试验中，研究人员设计了 10 个向导 RNA，让 dCas9-SSAP 编辑工具在近 10 个基因位点进行上千碱基的定点插入。试验数据显示，dCas9-SSAP 在千碱基规模的无错编辑效率达到了 20%，远超传统的 Cas9 基因编辑工具。
通过全基因组脱靶检测，研究人员发现在灵敏度检测范围之内，dCas9-SSAP 介导的基因编辑的脱靶率几乎为零，精确插入率普遍高于 99%。同时，在包括人类胚胎干细胞系在内的多种人类细胞中，该编辑工具都证明了有效性。
丛乐还告诉生辉，该系统的另一优势是蛋白尺寸非常小，约为 Cas9 的 1/5。在研究中，他们通过蛋白结构计算预测，共设计了 14 种不同的 SSAP 截断体。并得到尺寸减少 50% 且效率类似的最小化 dSaCas9-mSSAP 基因编辑工具，更小的尺寸便于 AAV 递送系统的包裹和递送。
（来源：上述论文）
计划开展临床前动物试验
在已发表的这项研究中，丛乐课题组对新型编辑工具 dCas9-SSAP 并实现了从 0-1 的概念突破。接下来，团队计划推进这项技术走向临床应用、实现落地转化。
“现阶段，我们已经在肝脏细胞和人类胚胎干细胞等多种人源化细胞系中验证了 dCas9-SSAP 的有效性。” 丛乐说。
（来源：受访者提供）
全新的基因编辑真正走向临床，还有很长的路要走。首先要选择适合的递送工具，据悉，丛乐课题组正在和相关机构合作开发能够递送 dCas9-SSAP 的新型脂质纳米颗粒（LNP），并将这种疗法应用于肝脏体内编辑。
下一步，他们计划推进在小鼠模型以及其他疾病模型中的体内验证，积累更多临床前动物试验数据，找到最优的临床转化方案，加快技术的落地转化。
“新一代” 基因和细胞疗法的突破方向有哪些？
CRISPR 作为一种颠覆性的基因编辑手段，从基因层面为治疗多种难治性疾病带来了治愈的希望。近年来，基于 CRISPR 技术的基因编辑疗法的产业化步伐加快，“全球基因编辑三巨头” CRISPR Therapeutics、Editas Medicine 和 Intellia Therapeutics 的基因编辑疗法全面走向临床试验，去年 Intellia Therapeutics 和 Editas Medicine 还公布了各自体内基因编辑疗法的临床 I 期数据。
“基因编辑领域发展日新月异，今天我们讨论的一些技术或者进展，可能半年之后又会是另一番景象了。随着技术的发展，安全有效的新型基因编辑技术也会不断推进新一代基因和细胞疗法的开发。” 丛乐对基因编辑领域的发展信心满满。
他认为，未来，新一代基因和细胞疗法的发展将会从多个角度取得突破。
（来源：sciencenews）
首先是找到真正能够带来革命性价值的基因疗法。体外基因疗法作为业内 “低垂的果实” 更易采撷，不过使用于体外基因编辑的细胞类型较少，适应症主要局限于血液系统相关疾病。“而体内编辑的治疗场景更为广泛，可以应用于眼睛、耳朵、神经系统、肌肉、肝脏、心脏等相关疾病。我认为，体内基因编辑疗法机会更大，这个方向会是具有革命性价值疗法的一大重要趋势。”
新一代基因编辑技术的开发离不开新型的基因编辑技术，而递送则是基因和细胞治疗始终绕不开的一个话题，新基因编辑工具对递送载体也提出了新要求。下一步需要开发能够递送新一代基因编辑工具的递送载体。
未来，另一个方向会是基因编辑治疗会日渐从罕见病推广到更多常见病中，尤其可能会从一些尚无有效疗法的慢性疾病率先切入。除了人类疾病场景以外，基因编辑在环境或者农业等领域的发展进程也会加快。
另一方面，基因编辑工具还会与多种学科交叉发展，形成一种 “基因编辑 +” 的概念。比如说，基因编辑工具可能会与合成生物学、AI 技术等技术结合，这可能会是加速基因编辑临床转化以及推进产业化进展的核心点。
参考资料：
https://www.nature.com/articles/s41556-021-00836-1
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