ACS Chem. Biol. | 模块化荧光传感器用于多种生物学事件的检测

Original ACS Publications ACS美国化学会

英文原题：A Modular Fluorescent Sensor Motif Used to Detect Opioids, Protein–Protein Interactions, and Protease Activity

通讯作者：Wenjing Wang, 密歇根大学

供稿人：李可心, 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章，题目为 “A Modular Fluorescent Sensor Motif Used to Detect Opioids, Protein–Protein Interactions, and Protease Activity” 。本文的通讯作者是来自密歇根大学的Wenjing Wang教授。

模块化的荧光传感器组件能够检测多种信号，如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质激活或抑制，可广泛应用于研究细胞过程。现有的模块化荧光传感器主要是基于环状排列绿色荧光蛋白（cpGFP）、split GFP和带有荧光抑制肽的GFP。其中cpGFP已广泛应用于实时探针的设计，这类探针具有可逆荧光变化的优势，从而能够提供关于细胞信号转导的高分辨时空信息。然而，基于cpGFP的实时荧光探针需要针对每一种靶标进行大量的工程设计，限制了其普适性。相对地，split GFP和GFP增强/抑制系统都能够检测PPI和蛋白酶活性。但由于信号不可逆，会随时间不断累积，因此不能提供这些细胞事件的时间信息。因此，需要一种新的基于GFP的时间控制集成传感器来提供细胞特定过程的时空信息。

作者发现了一种由cpGFP和单域抗体Nb39组成的新型荧光传感器组件，在cpGFP和Nb39融合表达并相互结合时，cpGFP的荧光团形成受到抑制，而当阿片类物质（opioid）结合其受体（OR）时，Nb39也与激活的OR结合，释放和激活cpGFP，发出荧光信号。该传感器此前被用作阿片类的传感器，称为SPOTIT。本文中作者证明该系统是高度模块化的，cpGFP-Nb39结合时荧光受到抑制，而分离时荧光被激活，针对该激活机制可设计两种策略，即通过Nb39与更高亲和力的蛋白结合或直接将二者连接部分的肽段进行切割（图1）。作者根据这两种策略对上述荧光传感器进行改造，通过化学双门控实现特定时间内的检测，对象包括阿片类分子、多种蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），以及蛋白酶活性。一系列化学门控的cpGFP-Nb39传感器组件被命名为“SPOTon”。

图1. 两种分离Nb39与cpGFP并激活荧光的方法

首先，作者利用rapamycin诱导的FRB和FKBP的异源二聚体对此前检测阿片类物质的不可逆的传感器SPOTIT添加了化学门控。将FKBP固定在cpGFP-Nb39的N端，将FRB固定在mu、kappa和delta三种阿片受体 (MOR、KOR和DOR) 的C端，仅在rapamycin诱导FRB和FKBP异源二聚后，阿片类物质才能激活传感器发出荧光信号（图2）。在证明该方法拥有较高信噪比和稳定性后，作者选取了效果较好的KOR和MOR体系对rapamycin的添加条件进行了优化。

图2. 化学门控阿片传感器（A）带有化学门控的SPOTon阿片检测示意图；（B）化学门控的阿片传感器（基于KOR、MOR和DOR）的共聚焦成像；（C）SPOTon阿片检测的定量结果

SPOTon阿片传感器表现出了240倍对rapamycin诱导的FKBP-FRB异源二聚的依赖，这表明了它在检测其他PPI方面的潜在应用。因此，作者将FKBP-FRB模块更换为其他相互作用蛋白质对，如sspB和ssrA，检测在添加阿片后的一段时间内的特定PPI（图3）。仅在相互作用蛋白质对彼此匹配时，才能激活SPOTon的荧光信号（图3B-C）。

图3. 利用化学门控的SPOTon传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

最后，作者应用另一种激活策略，在Nb39与cpGFP连接肽段处设置了特定蛋白酶的切割位点，在活性蛋白酶存在的条件下，该位点被切割，从而释放激活的cpGFP，发出荧光（图4A）。这种策略不需要膜蛋白OR的参与，因此不局限于细胞膜附近的检测，且信号更高。作者以TEV蛋白酶和HCV蛋白酶为例，展示了该传感器较高的灵敏度和信噪比。

图4. SPOTon用于检测蛋白酶活性

总而言之，本文开发了一套带有化学门控的SPOTon荧光传感器，并分别展示了在活细胞特定时间内对小分子、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白酶活性的原位实时检测。这套高度模块化的系统具有被纳入到多种工具设计中的潜力，可广泛应用于活细胞中生物学过程的检测与分析。

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ACS Chem. Biol. 2022, ASAP

Publication Date: August 4, 2022

https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00364

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