ACS Environ. Au首篇编辑良择 | O₂解耦在Rieske型非血红素铁加氧酶作用下的有机污染物氧化生物降解中的角色

Original ACS Publications ACS美国化学会

英文原题：

Elucidating the Role of O₂ Uncoupling in the Oxidative Biodegradation of Organic Contaminants by Rieske Non-heme Iron Dioxygenases

作者：Charlotte E. Bopp, Nora M. Bernet, Hans-Peter E. Kohler, and Thomas B. Hofstetter

通讯作者：Thomas B. Hofstetter, 瑞士联邦水科学技术研究所 (EAWAG), 苏黎世联邦理工学院 (ETH) 生物地球化学和污染物动力学研究所

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内容简介

瑞士联邦水科学与技术研究所Thomas B. Hofstetter教授团队，通过酶分析及稳定同位素分析，建立了对两种硝基芳烃二氧酶的O₂激活和底物羟基化的机制解析方法，定量分析了Rieske型加氧酶的O₂解耦，解释了污染物生物降解、活性氧的产生和微生物适应策略三者之间的联动机制。

文章亮点

研究背景

Rieske双加氧酶（RDOs）是一种非血红素亚铁加氧酶的一个亚群，参与多种有机物的分解代谢和生物合成过程。酶的芳香污染物具有广泛的应用和起源，包括制药、工业化学品和炸药，都是由RDOs催化的。芳香烃和脂肪烃与O₂的加氧作用是有机污染物生物降解的首要步骤。但是，反应底物在催化循环及RDOs驱动机制方面扮演的角色仍未被完全理解。

与其他非血红素亚铁加氧酶相比，RDOs只获取底物中用于还原O₂所需的四个电子中的两个。另外两种还原物质来自NADH氧化，并由Rieske簇电子转移蛋白提供。另外，在底物的羟基化和污染物转化之前伴有一系列负责酶促O₂活化的步骤（图1）。

该研究目的是评估O₂解耦与RDOs对芳香族底物氧化降解的相关性，并为评估污染物生物降解提供理论基础。本文选取2-硝基甲苯双加氧酶(2NTDO)、硝基苯双加氧酶(NBDO)两种重要的和特征良好的硝基芳烃双加氧酶作为代表性的RDOs。通过对2NTDO活性的全面评估，扩展了现有的NBDO实验数据，获得了O₂解耦的底物和酶的特异性。具体包括，（1）在体外酶分析的基础上，量化了不同底物的O₂解耦程度；（2）阐明了硝基芳烃双加氧酶的催化机制来表征RDOs对O₂解耦的基本反应；（3）通过比较甲基化、羟基化、氟化和氯化硝基芳香族底物的O₂解耦程度，研究了底物分子结构对氧合反应的影响。最后，该研究解释了两种RDOs在评估环境中污染物生物氧化降解过程的O₂解耦。

图1. 非血红素亚铁 Rieske双加氧酶模型的硝基苯双加氧酶的催化循环

研究亮点

图2a所示为不同NADH浓度下，不同转化程度的2-硝基甲苯的底物消减和产物生成。2-硝基甲苯几乎完全转化为3-甲基邻苯二酚和等量的亚硝酸盐，只产生少量的2-硝基苯甲醇。有机底物和产物的质量平衡证实了2NTDO进行了两种假设的羟基化反应。

3-与2-硝基甲苯相比，2NTDO羟基化生成其他底物的效率非常低。图2b表示了4-氯硝基苯的底物转化实验的结果。在0.04mol/mol NADH下，O₂消耗则明显增加，而底物消耗系数、V_s、双加氧系数、VNO₂^-均很小。所以，只有8%的O₂消耗被用于底物的羟基化，92%用于非生产性的O₂活化。

图2.不同NADH消耗量下，测定2次NTDO中底物、溶解O₂、有机产物和亚硝酸盐的浓度。黑线和阴影区域代表95%置信区间的线性拟合。2-硝基甲苯为底物(a)质量平衡代表2-硝基甲苯、亚硝酸盐和2-硝基苯甲醇的浓度。4-氯硝基苯(CNB)作为底物(b)质量平衡表示4-氯硝基苯和亚硝酸盐的浓度

图3所示，以硝基苯、甲基化、氟化、氯化、羟化和羟化硝基苯为模型化合物，研究底物分子结构对硝基芳烃活性的影响。除2-硝基甲苯外，所有底物都会导致大量的O2解耦，而这种O₂活化的非生产性途径主导了酶活性。

NBDO的f_O2-uc值在0.31±0.02（3-硝基甲苯）和0.74±0.01（4-氯硝基苯）小范围内波动。硝基苯酚没有被NBDO、2NTDO羟基化。同时，NBDO和2NTDO表现出非常明显的底物特异性。例如，在2NTDO和NBDO的测定中2-氯硝基苯的f_O2-uc值相差43%。只有3-氟硝基苯在NBDO和2NTDO下的O₂解耦程度均小于10%。值得一提的是，2NTDO的2-硝基甲苯的双氧化底物缺乏O₂解耦，而NBDO以硝基苯为底物的氧合效率较低(f_O2-uc=0.67±0.01)。

图3.2-硝基甲苯双加氧酶(2NTDO)和硝基苯双加氧酶(NBDO)与取代硝基苯的O₂解偶联程度

通过分析不同转化程度下剩余溶解氧的¹⁸O/¹⁶O同位素比值，推导出2NTDO下所有硝基芳香底物的O₂的同位素动力学效应，即¹⁸O-KIEs (图4a)，发现¹⁸O-KIEs均在1.013-1.020之间，均值为1.016，因此，这与导致O₂解偶的基本反应步骤无关(图4b)。这一结果表明，不同硝基芳香族底物都会生成一种铁-氧络合物。

图4.不同底物下加入2NTDO导致的¹⁸O/¹⁶O比值变化（a）和O₂活化导致的¹⁸O-KIE变化

如图5a所示，所有碳同位素动力学效应，即¹³C-KIE值都很小，在1.01上下变化。图4b中，NBDO的相同类型数据差异推测原因是从羟基化中分离的C同位素不会改变物种4中在O₂解偶联时硝基芳香族底物的¹³C/¹²C比例。在这种情况下，随着f_O2-uc值的增加，部分发生可逆反应改变了剩余底物的¹³C/¹²C比值。因此，底物C同位素分馏随O₂解偶联程度的增加而增强。

图5.各种底物双氧合¹³C-KIEs与未偶联的O₂活化的部分(f_O2-uc)变化(a.2NTDO;b.NBDO)

该研究评估了与底物取代基类型和位置以及酶的活性位点相关的结构因素的后果，来阐明图6中所示的不同底物特异性和O₂解偶行为的可能原因。2NTDO和NBDO具有95%的序列同源性，在其活性位点残基上仅略有差异。如图6a所示，2NTDO与2-硝基甲苯和其他邻位取代底物的O₂解耦性降低。这些化合物不被这两种酶中的任何一种双氧合，所以meta-中氯和甲基取代基的f_O2-uc值的增加均可解释为活性位点的底物拟合差。观察在NBDO中f_O2-uc值的不同趋势（图6b），底物硝基苯表现出相对较高的O₂解偶程度（约60%），在邻位取代和对位取代硝基苯也发现同样现象。通过综合分析甲基和NBDO簇的甲基、氟取代和氯取代硝基苯的f_O2-uc值，说明了底物的化学结构可能是O₂解偶联的关键因素。

图6.不同底物的芳香族取代基的位置上不同取代硝基苯的官能团的O₂解耦程度(f_O2-uc)变化(a.2NTDO;b.NBDO)

意义

单体同位素分析技术（compound specific isotope analysis,简称CSIA）已成功应用于指示不同有机污染物的酶催化转化途径，主要是通过定量解析断键处的同位素效应。但是，这项工作观测到的CSIA数据较以往工作更为复杂，原因是RDOs催化循环下O₂解偶过程可以释放尚未反应的底物，这将干扰剩余底物的单体同位素信号，同时，RDOs造成的底物羟基化反应也可能引入未知程度的同位素分馏。因此，这项工作强调了理解与特定酶相应的O₂解耦过程和机制的必要性，也据此提出重新评估相关生物降解实验获取的CSIA数据的必要性。

该项目获SNF的资金支持，研究成果已发表于ACS Environmental Au。

*感谢中国科学院广州地球化学研究所谢雨初同学和金彪研究员撰写本文中文解读！

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ACS Environ. Au 2022

Publication Date: July 7，2022

https://doi.org/10.1021/acsenvironau.2c00023

关于 ACS Environmental Au

主编：Shelley D. Minteer

执行主编: Xiang-Dong Li

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