JCIM近期发文揭示D1135E点突变增强CRISPR-Cas9与PAM基序识别特异性的分子机制

Original ACS Publications ACS美国化学会

英文原题：Molecular Mechanism of D1135E-Induced Discriminated CRISPR-Cas9 PAM Recognition

通讯作者：Zhicheng Zuo (左志成)，上海工程技术大学

作者：Minjie Kang, Zhicheng Zuo, Zhixiang Yin, Jianrong Gu

背景介绍

细菌CRISPR-Cas9系统已经被改造为一种强大的基因编辑工具，但该系统具有脱靶活性，不利于临床应用。靶DNA上必须含有一段称之为原间隔序列邻近基序（PAM）的序列，方能被Cas9蛋白结合。NGG PAM是当前应用最为广泛的酿脓链球菌Cas9的经典（即最佳）识别序列。野生型（WT）Cas9亦能作用于其它PAM基因位点，从而导致脱靶效应。研究人员筛选出一个Cas9突变体（D1135E），它对NGG以外的PAM序列的编辑活性明显削弱。然而，D1135E增强Cas9-PAM识别特异性的分子机制仍然是个谜团。

文章亮点

2022年6月6日，上海工程技术大学化学化工学院左志成副教授团队在化学信息学和人工智能研究领域的国际权威学术期刊 Journal of Chemical Information and Modeling 上发表了题为“Molecular Mechanism of D1135E-Induced Discriminated CRISPR-Cas9 PAM Recognition”的研究论文，揭示了D1135E这一单点突变增强CRISPR-Cas9与PAM基序识别特异性的详细分子机制。这一发现为今后基于结构和动力学信息开发出具有更高编辑精度的CRISPR-Cas9工具提供了重要的理论依据。

左志成课题组构建了四个模拟体系（即WT-NGG，D1135E-NGG，WT-NAG，和D1135E-NAG），并对这些体系展开微秒级的分子动力学模拟。结果发现，上述体系中PAM碱基与Cas9形成的特异性氢键数目依次递减（WT-NGG = D1135E-NGG > WT-NAG > D1135E-NAG）。与WT Cas9类似，D1135E突变体亦能与经典NGG PAM形成2对稳定的氢键相互作用。尽管WT Cas9与非经典NAG PAM间能够动态维持3个氢键，D1135E这一微小改变却使得Cas9与NAG PAM形成的氢键总数在2~3个之间。自由能计算也表明PAM双链体与Cas9的结合亲和性在这四个体系中呈现依次减弱的趋势（WT-NGG ≈ D1135E-NGG > WT-NAG > D1135E-NAG）。这一趋势与基因编辑实验完全吻合，揭示D1135E突变体对经典NGG PAM基序识别特异性的提高源于其对非经典PAM基序氢键作用力的削弱。

作者随后对体系间的结构动力学特征进行了细致比较，发现D1135E点突变和PAM碱基替换（NGGàNAG）可诱导迥异的构象变化。在D1135E-NGG体系中，Cas9上PAM识别残基Arg1333的侧链表现出一定程度的弯折，推测这与D1135E突变引发PAM双链体向PAM相互作用（PI）结构域一侧位移有关。相较于WT-NAG，D1135E-NAG体系中的PAM双链体发生倾斜，这不利于NAG的中间碱基（dA2）与Arg1333形成稳定的氢键联结。

进一步分析表明D1135E突变可引发PAM双链体另一侧的楔形（WED）结构域发生局部去折叠，这使得WED结构域的动力学增强。同时，在D1135E诱导的空间位阻和静电排斥的作用下，PAM双链体最终发生倾斜，致使D1135E突变体只能与非经典NAG PAM形成两个稳定的氢键作用。总之，这些发现表明Cas9蛋白具有相当程度的结构可塑性，可通过诱导契合机制结合不同的PAM“底物”。该研究对高靶向精度CRISPR-Cas9体系的理性设计具有启发意义。

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J. Chem. Inf. Model. 2022, 62, 12, 3057–3066

Publication Date: June 6, 2022

https://doi.org/10.1021/acs.jcim.1c01562

IF 2021: 6.162

Citaions 2021: 30,162

CiteScore 2021:7.7

The Journal of Chemical Information and Modeling publishes papers reporting new methodology and/or important applications in the fields of chemical informatics and molecular modeling.Astute chemists, computer scientists, and information specialists look to this monthly’s insightful research studies, programming innovations, and software reviews to keep current with advances in this integral, multidisciplinary field.

主编：Kenneth M. Merz Jr.（Michigan State University）
副主编

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