Nucleic Acids Res. | m-AMSA抗非洲猪瘟病毒pP1192R双功能机制的结构基础
中国科学院微生物研究所高福团队在“Nucleic Acids Research ”在线发表的题为“Structural basis for difunctional mechanism of m-AMSA against African swine fever virus”的研究论文。在本项研究中，作者展示了pP1192R的atp酶结构域的晶体结构，并测定了pP1192R全长在多个酶活性阶段、载脂蛋白和DNA切割状态下的冷冻电镜(cryo-EM)结构，从结构上定义了这种进化上独特的Topo II，并全面揭示了病毒Topo II调节DNA拓扑变化的结构基础。
全长pP1192R在哺乳动物细胞中产生，随后纯化用于酶和结构分析。重组表达的pP1192R蛋白是均匀二聚体，分子量约为221 kDa，通过凝胶过滤层析和分析性超离心确定(图1A, B)。然后通过松弛试验证实该纯化的pP1192R蛋白的酶活性(图1C)。
为了捕获全长pP1192R的完整结构，作者用单粒子冷冻电镜对蛋白质样品进行分析。在收集和处理2134张cro - em图像后，鉴定并重建了两种类型的粒子，分别为状态1和状态2，总分辨率分别为2.77和2.98 Å，分别为131 161和78 195个粒子。在这两种状态下，仅可以观察到DNA结合/切割结构域的电子密度，而n端ATPase结构域的电子密度则缺失。
在基于EM密度图的原子模型构建过程中，pP1192R DNA结合/切割结构域的载脂蛋白结构在两种状态下都得到了很好的解析，蛋白质的c端(C-gate)采用不同的构象，相应的被描述为“开放”(状态1)和“关闭”(状态2)。这些载脂蛋白结构可以被追踪到779个残基，从D416到H1192(图1D, E)，除了含有残基G471-N501的区域。尽管基于系统发育分析，pP1192R与其他原核或真核Topoⅱ存在高度差异，但pP1192R的DNA结合/切割结构域在整体二聚体结构以及子结构域组装特征方面与其他Topoⅱ具有高度相似性。
pP1192R缺乏可变c端结构域(CTD)，而CTD通常存在于其他Topo ias同源物中，并有助于酶的催化活性。Topo IIAs中DNA结合/裂解核心的其他典型结构域，即金属结合拓扑异构酶/引物酶(TOPRIM)结构域，含有催化酪氨酸(pP1192R中的Y800)的翼状螺旋结构域(WHD)、Tower结构域和螺旋状螺旋结构域在两个pP1192R载子结构中得到了很好的说明(图1E）。与其他Topo IIAs一样，来自两个原聚体的TOPRIM和Tower结构域相互作用构建dna结合槽的侧壁，两个WHD结构域通过各自的A ' α3和A ' α4螺旋结合在一起形成dna结合槽的基部。在封闭状态下，一个额外的二聚体界面，C-gate，是由两个原聚体的卷曲螺旋之间的相互作用形成的，在开放状态下保持了~ 16 Å的距离(图1E)。当比较两种载子状态时，dna结合槽中没有明显的构象变化，而螺旋状螺旋发生了明显的构象重排，呈现出C-gate在打开到关闭之间的动态循环(图1F, G)。每个原聚体的螺旋状区域(从a ' α14到a ' α18)在关闭状态下相互移动，最远端的移动距离为~ 13.4 Å，相对于打开状态的重新定向为~ 12◦。这两种结构与最近报道的来自基因型II ASFV (Georgia07)或基因型I ASFV (L60)的pP1192R载子结构重叠良好，尽管dna结合/切割结构域存在27或28个氨基酸差异。这些残基都位于远离DNA结合或切割位点的位置，与pP1192R的功能保守性一致。
通过对具有代表性的Topo II同源物的序列比对和结构叠加，确定了pP1192R各结构域内的详细特征。首先，在pP1192R的TOPRIM结构域内仅检测到额外的氨基酸(insert1)，涉及残基V481-V494。在载脂蛋白结构中，该区域与侧翼残基(G471-N501)在EM密度图中缺失，而在其他Topo iaa中，该区域很好地表现为参与DNA结合的环。第二，在pP1192R和原核Topo ias中，一个独特的a ' α10 '螺旋位于进化上保守的a ' α10螺旋的外围，并与a ' α10螺旋和a ' α14螺旋相互作用。此外，在pP1192R中发现了位于TOPRIM结构域DNA结合界面的两个结构特征，即a ' α11 '螺旋和B ' β12链之间的相对较短的连锁(a ' α11 '螺旋)和连接a ' α12和a ' α13螺旋的7个氨基酸插入(insert2)引入的较长的环。最后，与whd的保守性相比，DNA结合/切割结构域的序列变异最大的区域是螺旋区A′α15和A′α16螺旋之间的区域。在pP1192R中，该区域被很好地重建为两个螺旋，分别命名为A’α15’和A’α15”。这两个螺旋与A′α14螺旋紧密结合，而两个螺旋的连接环指向塔结构域的底部，并通过与A′α8螺旋的相互作用而稳定。
图1：apo状态下ASFV pP1192R的生化特性及整体结构
受pP1192R与其他Topo IIA整体结构相似性的启发，作者接下来研究了一些Topo IIA抑制剂在蛋白质水平上阻止pP1192R功能的能力。在pP1192R或其应答靶点与超卷曲pUC19质粒存在的情况下，首次对7种具有代表性的第二、第三和第四代氟喹诺酮类药物和一类新型细菌拓扑异构酶抑制剂(NBTI)中毒原核Topo ii以及2种靶向真核Topo ii的抗癌药物进行松弛试验。在氟喹诺酮类药物中，只有环丙沙星和托氟沙星对pP1192R有一定的抑制活性(图2A)。与它们对原核Topo ias的显著效力相反，这两种化合物即使在极高的浓度下(分别高达0.8或3 mM)也不能完全抵消pP1192R的松弛功能。
在真核Topo II毒物中，m-AMSA对pP1192R表现出明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，在高浓度下可完全抵消pP1192R的松弛功能(图2B)。DNA裂解实验进一步阐明环丙沙星、托氧氟沙星和mAMSA对pP11192R的抑制机制。令人惊讶的是，m-AMSA，而不是环丙沙星和托氟沙星，诱导了缺口和线性DNA产物，随着药物浓度的增加，表明m-AMSA对pP1192R的联合工作模式，即DNA底物的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)的产生(图2C)。鉴于pP1192R在ASFV复制中的重要作用，并且有证据表明mAMSA对pP1192R有抑制作用，作者进一步测试了m-AMSA是否可以抑制猪肺泡巨噬细胞(pam)中的ASFV复制。m-AMSA对pam的细胞毒性首先通过细胞活力测定进行了测试。当浓度>10 μM时，mAMSA抑制了pam的增殖，处理24小时后，50%的细胞毒性浓度(CC50)约为23.6 μM，而处理48小时后，CC50降至约16.8 μM。在随后的抗病毒效果分析中，作者选择10 μM作为m-AMSA的最佳无毒浓度。因为在这个浓度下，只有微弱的（暴露48小时后为12.7%）或无（暴露24小时）细胞生长抑制。采用p72基因实时荧光定量pcr和血液吸附(HAD)法检测m-AMSA对病毒产生的影响。值得注意的是，m-AMSA对ASFV DNA水平的抑制作用呈剂量依赖性，与单独感染病毒的细胞相比，在浓度为10 μM的药物处理24和48小时后，m-AMSA对ASFV DNA水平的抑制作用分别降低了97.4%和99.8%(与DMSO相关)(图2D-F)。经过24小时或48小时的药物治疗，估计减少50%病毒产量的抑制浓度(IC50)分别为1 μM或0.4 μM。进一步的HAD测定，通过识别特征的“玫瑰花结”形成，反映了红细胞在asfv感染巨噬细胞表面的吸附，提供了类似的结果。m-AMSA使上清液中传染性子代ASFV颗粒滴度呈剂量依赖性降低，10 μM药物处理24或48 h后，滴度最高，分别从5.1 lg HAD50/ml降至3.6 lg HAD50/ml(与DMSO相关93.3%)或从6.6 lg HAD50/ml降至4 lg HAD50/ml(与DMSO相关99.3%)(图2G-I)。
由于m-AMSA也是真核生物Topo ii的一种强效毒药，因此进行了单细胞电泳分析(彗星测定)以阐明m-AMSA抗病毒作用的靶点。将感染ASFV的PAM细胞(MOI = 1)暴露于m-AMSA (100 μg/ml)中，时间为16 ~ 18 hpi。将感染但未暴露于m-AMSA的PAM细胞和未感染但暴露于m-AMSA的PAM细胞作为对照。在感染和未暴露组中未发现彗星，表明仅ASFV感染不能诱导可检测到的DNA片段。尽管在抗病毒实验中使用的药物浓度对细胞生长几乎没有影响，但在未感染和暴露组中仍然观察到DNA片段化，这表明宿主Topo II参与了m- amsa诱导的DNA片段化。然而，与感染和暴露组相比，其明显程度较低。这表明m-AMSA通过联合效应影响ASFV复制，即干扰ASFV pP1192R(直接抑制)和宿主PAM细胞(间接抑制)的活性。
图2:评价代表性Topo II毒物对pP1192R的抑制作用及m-AMSA对ASFV复制的影响。
pP1192R的差异抑制剂选择性表明这种进化上独特的病毒Topo II的特异性，这需要进一步了解pP1192R的工作状态和药物结合位点的原子细节。为此，通过添加DNA双工、mAMSA和AMP-PNP制备DNA结合pP1192R的冷冻电镜样品。与其同源物的结构一致，pP1192R的二聚ATPase结构域在2D分类中表现出灵活性，并且相对于DNA结合/切割结构域显示出不同的方向(图3A)。通过ab-initio三维模型计算了271 076个粒子，并解析了全长pP1192R与DNA底物、抑制剂和AMP-PNP复合物的整体结构。为了获得柔性atp酶区域的信息，对该区域进行了以3d为重点的分类，产生了两类颗粒。虽然分辨率很低，但这两种结构显示了atp酶在pP1192R的DNA结合/切割结构域上的正交取向，并有明显的摆动(图3A)。
为了提供ATP酶结构域的详细信息并支持全长pP1192R的模型构建，利用截断的pP1192R-ATP酶蛋白在大肠杆菌细胞中作为可溶性蛋白表达，在1.8 Å处用x射线晶体学测定了pP1192R与ATP非水解同源物(AMPPNP)配合物中ATP酶结构域的原子分辨率结构。最终精化模型具有合理的r因子和立体化学。电子密度图质量较好，只有少数柔性末端残基，含有R70T76和I334-R343的两个区域无序。有趣的是，正如Chang等人所详述的，R70-T76区域在不同的氧化还原条件下表现出很大的构象变化，涉及C72和C138之间二硫键的形成和断裂，这可能反映了pP1192R的氧化还原调节机制。研究结果的结构与还原形式和氧化形式都显示出很高的总体相似性，RMSD值分别为0.18和0.102 Å。在结构的这个区域观察到的柔韧性可能反映了过渡到还原或氧化构象的中间状态。
利用Dali服务器对已知结构的完整蛋白质数据库(PDB)进行结构比较，发现pp1192r - atp酶与其真核和原核同源物具有很大的结构相似性，而大多数类似于真核Topo ias的atp酶结构域。pp1192r - atp酶的同源物呈保守的心形二聚体结构，每个原聚体由两个很好表征的区域组成，即n端GHKL atp结合折叠区和C端换能器结构域(图3B, C)。对代表性Topo ias中atp酶的结构比较发现，这两个区域的典型二级结构元件(GHKL折叠中的8条反平行β-链加4条α-螺旋，以及传感器结构域的4条β-链加2条α-螺旋)在pP1192R中是保守的。真核Topo ias (β1和β2链)特有的氨基酸插入也存在于pP1192R中，具有相应的构象。pP1192R ATPase中结合的AMP-PNP与其他Topo IIAs ATPases具有相同的取向，构成结合袋的二级结构元件是保守的(图3D)。主要的相互作用由β4链上的残基、α4螺旋和α5和α6螺旋之间的延伸环(称为“atp盖”)介导，而先前定义的换能器结构域的qtk环与AMP-PNP的γ-磷酸形成盐桥。
然而，在pP1192R- atpase的结构中也观察到一些意想不到的局部特征。首先，pP1192R缺乏延伸的n端，它形成一个短螺旋(α1)，并在相反的原聚体的ATPbinding位点上形成拱形，部分构成了其他Topo IIA atpase的二聚体界面。其次，在pP1192R- atpase顶端的β4链和α5螺旋之间的长连接环中存在一个额外的α4 '螺旋，该螺旋由pP1192R中独有的6个氨基酸(A108-K113)插入(insert3)产生。此外，在pP1192R-ATPase换能器结构域的底部发现α9螺旋与β11链之间存在一个短链，并在β11和β12链之间形成一个延伸的中间环，其额外的310螺旋(η1)可能是由于β11链在序列上的起始位置不同所致。这个延伸的中间η - 1螺旋向靠近对面原聚体真核插入区的η - 2螺旋突出，将其推向一个明显的方向~ 8 Å，远离在S. cerevisiae Topo II结构中观察到的对应物(图3E)。最后，真核Topo IIAs序列中的k环被证明对DNA链传递活性很重要，它在pP1192R中有些保守，由三个赖氨酸和一个精氨酸组成。这个区域在pP1192R中也是无序的(图3C)，正如之前在人类或酵母Topo ii的结构中所示。
图3：pP1192R atp酶结构域的结构
为了提高DNA结合/切割结构域的分辨率，进行了3D聚焦细化。以2.76 Å分辨率生成DNA结合/切割结构域的重建。高质量的EM图谱使我们能够建立pP1192R DNA结合/切割结构域与DNA双工和m-AMSA复合物的原子模型(图4A, B)。蛋白质的二级结构元件，所有DNA碱基对，两个m-AMSA分子和离子(可能是Mg2+，因为它在缓冲液中呈现)被很好地分解。该复合物的整体结构类似于真核生物和原核生物Topo IIAs的药物中毒切割复合物，其C-gate采用封闭构象(图4B)。特别是，在载子结构中紊乱的insert1区域，被清楚地识别为由两条反平行的β-链组成的β发夹，两条β-链之间有一个长介入环，两侧有两个小螺旋(图4B, C)。它垂直定向，直接指向atp酶结构域。为了进一步描述，将它们分别命名为B ' η2 '， B ' β3 '， B ' β3 '和B ' α2 '。与其他Topo IIADNA复合物一样，DNA双链被困在DNA门中，并通过将每个原聚体的脯氨酸(P852)插入到DNA小槽的两点上对称地连接(图4B, D)。
令人惊讶的是，EM密度清楚地支持DNA双链的不同裂解状态(图4D)。在一条链中，在-1和+1核苷酸之间观察到磷酸二酯键断裂，+1腺嘌呤的5 -磷酸共价附着在裂解活性位点的催化酪氨酸(Y800)上，证实了裂解复合物的形成。一个m-AMSA分子被发现嵌入在断裂的可裂磷酸盐两侧的DNA碱基对堆栈(+1/+4和-1 /+5)中。为了进一步简化描述，作者将这个裂解后的位点命名为site 1。不过,相干密度EM地图的其他DNA链,没有发现磷酸二酯键断裂在预期的易裂开的磷酸盐,指示一个pre-cleavage状态。m-AMSA DNA基地四个碱基对之间的分子堆积远离网站1 m-AMSA,虽然不同的方向(图5)。此外,一个额外的密度出现桥接Y800的酚羟基和+ 1的5◥磷酸腺嘌呤,这让人联想到经典双金属催化模型中金属离子A2+在中间态的位置。在这种中间状态下，金属离子A2+与可裂磷酸盐的桥接5 -氧和催化水或核糖羟基的非桥接氧原子配位，并激活亲核攻击。因此，作者提出额外的密度为A2+，并将该预解理位点称为site 2。高分辨率结构揭示了蛋白质、DNA双链和金属离子之间的详细相互作用。对于Site 1，存在典型的裂解后状态，+1腺嘌呤的5 -磷酸酪氨酸部分和-1胸腺嘧啶的3 -氧阴离子基团相隔约7 Å(图4D)。Site 1的单个Mg2+始终位于S. cerevisiae Topo II结构中先前定义为B2+的位置。并且通常显示在Topo ii解理配合物的分解结构中。在pP1192R中，该Mg2+主要与D541配位，与E…DxD基序的DT(-1)和另外两个残基(E438和D539)有轻微的接触(图4E)。对于Site 2, A2+的位置为7 Å，距离B2+较远，并与Y800的可剪切磷酸盐和亲核羟基同时协调。在离子-蛋白质-DNA相互作用位点之外，广泛的蛋白质-DNA相互作用主要发生在从药物插入位点到DNA弯曲位点(碱基对-1 /+5、-2 /+6、-3 /+7和-4 /+8)以及WHD、TOPRIM和Tower结构域之间。大多数参与DNA结合的二级结构元件在Topo ii中是保守的，除了pP1192Rspecific insert1区域。在这个区域，发现了强有力的蛋白质-DNA相互作用，然而，只有两个小螺旋B ' η2 '和B ' α2 '残基，而β-发夹不参与DNA相互作用(图4C)。蛋白质与DNA的相互作用主要与磷酸和核糖骨架有关，但DNA弯曲位点除外。在这个位点上，pP1192R的P852虽然不保守，但它继续发挥着与异亮氨酸在其同源物中的等效作用:通过将侧链插入DNA碱基对的排列中来弯曲DNA。
将m- amsa中毒的dna结合/切割结构域与载脂蛋白结构(c门关闭状态)进行比较，揭示了两种原体dna接触区域的相对构象取向(图4g - I)。DNA结合后，所有这些区域，TOPRIM、Tower和WHD都发生了向DNA底物靠近的运动，导致原聚体内部结构域间距离被压缩，DNA结合槽变窄。另一方面，这些移动增加了两个原聚体之间的距离，这体现在Tower区域远离另一个原聚体相邻的TOPRIM结构域的移动，以及whd相互远离的移动(图4G)。DNA结合前后催化酪氨酸之间的距离以及金属结合基序(E…DxD)的催化酪氨酸与酸性氨基酸之间的距离的测量更准确地详细反映了上述构象变化，并进一步表明pP1192R与其他Topo IIAs结合后构象变化的趋势一致。
图4：pP1192R-DNA-m-AMSA复合物的结构
在pP1192R结构中，发现两个m- amsa嵌入在DNA碱基对(+1/+4和-1 /+5)之间，相距4个碱基对，但方向不同(图5A)。对于这两个位点，m- amsa的平面吖啶发色团通过范德华作用和π -π相互作用平行插入碱基对，其位置与先前在m- amsa毒化的人类Top i - β结构中显示的位置相同，消除了碱基对之间的堆叠相互作用。虽然吖啶发色团主要介导m-AMSA与插入位点两侧DNA碱基的相互作用，但甲磺酸-间甲氰胺基团也参与药物-DNA相互作用，特别是其中的甲氧基苯胺部分。
进一步分析药物-蛋白质接触网络，揭示mAMSA与pP1192R的两种不同的切割位点特异性结合模式(图5B - E)。在site 1和site 2，特异性的药物-蛋白质相互作用主要涉及m-AMSA的庞大的甲磺酸-间甲酰苯胺基团，尽管采用不同的取向，而吖啶发色团则从A ' α4螺旋上完全结合到M756的侧链上(图5A)。在Site 1, DNA断裂发生的地方，甲磺酰马尼酯头向与DNA断裂相反的方向突出(图5B)。这个方向主要由甲氧基苯胺部分与G471之间存在氢键和一组范德华力，而甲磺酰胺部分与K503和V504侧链之间几乎没有接触(图5C)。尽管取向相似，但pP1192R Site 1中甲磺酰胺部分的对接角度与人类Topo i β相比进行了微调，接触较少(图5F)，这是m-AMSA的原始靶点。这种差异可能是由于药物结合位点的序列差异，因为人类Topo IIβ中稳定药物头部部分的关键残基，A521, E522, R503和P455在pP1192R中都是不同的。
与此形成鲜明对比的是，m-AMSA在Site 2上的甲磺酸-m-阿尼西酯基团指向所谓的可剪切磷酸盐，甲基头固定在由B ' β3链与B ' η2 '螺旋(B ' β3B ' η2 '环)连接环上的L470、G471、G472和V473以及B ' α4螺旋上的I548组成的疏水袋中(图5D、E)。甲氧基苯胺部分进一步被B ' β3-B ' η2 '环和DNA链夹在中间，甲磺酰胺部分通过与DNA裂解相关的E438形成氢键来稳定。在这个定位中，证实了广泛的相互作用，与Site 1中鉴定的24个接触点相比，共有69个接触点与蛋白质接触，表明Site 2中药物-蛋白质相互作用更广泛。由于Site 2的DNA链是完整的，并且在DNA链断裂的位置没有发现与Site 2一致的m-AMSA取向，作者认为Site 2-like取向的m-AMSA可能通过阻止DNA切割和稳定切割前酶- DNA复合物来阻碍pP1192R的功能。
图5：m-AMSA抑制pP1192R双模式的结构基础。
该研究深入解析了pP1192R的ATP酶结构域的晶体结构，并通过冷冻电镜技术测定了pP1192R全长在多个酶活性阶段、结合载脂蛋白以及DNA切割状态下的结构，从而在结构上定义了这种进化上独特的Topo II，并全面揭示了病毒Topo II调节DNA拓扑变化的结构基础。值得注意的是，pP1192R展现出独特的抑制剂选择性，在多种代表性的Topo II毒物中，唯有真核Topo II毒物m-AMSA能通过靶向pP1192R显著抑制ASFV的复制。进一步地，m-AMSA与pP1192R-DNA复合物的结构揭示了m-AMSA对pP1192R的双重功能机制。该研究还揭示了pP1192R药物结合位点的详细结构信息，为开发针对Topo II的特异性抗病毒药物提供了新的思路。
在过去的三十年里，结构生物学极大地促进了我们对拓扑异构酶(许多生命形式中的基本酶)如何工作的理解，并导致对特异性靶向这些酶的药物的深刻理解。在这项研究中，作者展示了唯一已知的由哺乳动物感染病毒表达的II型拓扑异构酶pP1192R在不同酶促阶段的结构，全面揭示了pP1192R调节DNA拓扑变化和药物-蛋白相互作用的结构基础。pP1192R的巨大序列差异和明确显示的特定结构特征都证明了其在真核生物和原核生物Topo II之间的独特进化地位。然而，pP1192R的整体结构以及酶促阶段之间的构象变化与其他Topo i基本相同。这与其酶功能的保守性一致，侧面反映了拓扑异构酶在功能上的不可替代性。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39166497/