【前沿速递】Advanced Science：山东大学展鹏教授课题组在高效广谱抗耐药性抗冠状病毒药物领域取得新进展

在后疫情时代，尽管新冠病毒疫情得到了一定程度的控制，但病毒仍在持续变异。当前，奥密克戎（Omicron）变种，特别是JN.1和XDV系列，成为了全球流行的主要毒株。世界卫生组织（WHO）最新警告指出，新冠病毒在今年夏季出现了令人担忧的反弹现象，且病毒变异速度加快[1]，导致出现了严重的耐药株。中国疾控中心的数据显示，近期新冠病毒阳性率最高达21.1%，阶段性流行成趋势明显，XDV变异株或将成为国内主要流行株。面对这种形势，这表明疫情防控的挑战依然严峻。同时，我们还必须警惕其他呼吸道疾病，如流感，支原体感染等，这些疾病的存在增加了防控的复杂性。因此，迫切需要开发高效且低毒的广谱抗病毒药物来加强药物储备，以更好地应对疫情反复和未来新的疫情挑战[2]。

2024年9月25日，山东大学展鹏教授课题组联合韩国化学技术研究院传染病治疗研究中心的Meehyein Kim教授及德国波恩大学Christa E. Müller教授等合作者，在国际权威期刊Advanced Science（IF=14.3，Q1）在线发表了题为“Miniaturized Modular Click Chemistry-Enabled Rapid Discovery of Unique SARS-CoV-2 M^pro Inhibitors with Robust Potency and Drug-like Profile ”的研究论文。该团队将结构生物学与模块化反应导向的微量合成技术通过整合式创新，快速发现了一种新型的SARS-CoV-2 M^pro抑制剂C5N17B，具有高效的抗病毒活性及优异的广谱抗耐药性，为后疫情时代的广谱抗病毒药物研发提供了优质的候选分子。

众所周知，传统的小分子药物开发过程耗时且成本高昂，通常需要数年时间才能发现一个优质的优选药物，再需要3-5年时间才能将候选药物推进到临床试验阶段。面对新发疫情及快速传播、极易突变的病毒，需要更快速高效的方法来发现和开发新药。点击化学（Click Chemistry）是由Sharpless教授提出并在其后逐步完善的一个合成概念，因其在2022年荣获诺贝尔化学奖而备受瞩目，已成为多个学科的研究热点。它的核心理念是：合成化学要以分子功能为导向，通过“模块化搭积木”的方式快速可靠地完成结构多样性分子的化学合成，是一种高效的可用于药物发现的“化学工具箱”。其中，一价铜催化的叠氮化物-端炔烃环加成反应（CuAAC）最具代表性，前期山东大学等研究团队通过此模块化反应构建的微量合成筛选体系，发现了多类强效选择性的生物活性分子。该策略可以在96或者384孔板上进行三唑分子库的合成，无需额外的纯化步骤，即可实现将反应产物无缝转移到酶活水平和细胞水平活性测定。利用该“微量合成-直接筛选”策略，无需常规的“设计-合成-分离纯化-活性评估”的多次循环过程，即可高效合成具有优势片段组合库和生物学活性快速评估；该“Direct-to-Biology”策略用于聚焦型化合物库的高通量合成和生物活性筛选，从而大大提高了先导化合物发现和优化的效率。

图1. 基于Click模块化反应的三唑聚焦型化合物库组装及Direct-to-Biology策略

SARS-CoV-2通过其3C样蛋白酶/主蛋白酶（3CL^pro、M^pro）来切割病毒的多蛋白前体，从而促进病毒复制。3CL^pro是一种潜在的药物靶标，因为它在病毒生命周期中起着至关重要的作用，并且与其他冠状病毒相比，在进化上相对保守，这意味着针对它的抑制剂可能对多种冠状病毒都有效。基于课题组前期研究基础（J. Med. Chem. 2022a/b, 2023），为了加快发现全新骨架SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂，在结构生物学的指导下，创新性地采用了一种基于点击化学的模块化微量合成的方法来构建化合物库。在这项研究中，研究团队利用该模块化反应在96孔板中快速建立了包含268种化合物的聚焦化合物库（图1），以发现SARS-CoV-2 M^pro的高效抑制剂。通过直接活性筛选，鉴定出一系列新型的1,2,3-三唑-二氮杂双环辛烷衍生物，作为具有优异的抗SARS-CoV-2活性的M^pro强效抑制剂。值得注意的是，化合物C5N17B显示出亚微摩尔级的M^pro抑制活性（IC₅₀ = 0.12 μM），远远超过先导化合物GC-14（IC₅₀= 0.75 μM）及AA-625（IC₅₀ = 0.904 μM）。其细胞活性（EC₅₀ = 78 nM，CC₅₀ >100 μM，Calu-3细胞系）显著优于上市药物Nirmatrelvir（EC₅₀= 1.95 μM）及最新一代药物Ensitrelvir（EC₅₀= 0.11 μM），且能广谱抑制HCoV-OC43等多种冠状病毒及SARS-CoV-2变异株（Gamma、Delta和Omicron, EC₅₀ = 0.13~0.26 μM）。进而，利用反向遗传学技术证明了C5N17B能够持久抑制奈玛特韦双突变株T21I/E166V、L50F/E166V（EC₅₀分别为0.26和0.15 μM）。此外，结构生物学阐明了其独特的“蝎形”结合模式（噻吩和三氮唑环之间的弯曲构象）。与现有的M^pro抑制剂如Nirmatrelvir和Ensitrelvir相比，C5N17B的“侧翼”噻吩基团占据了一个全新位点S2c（图2），S2c口袋的噻吩环、S2口袋的三唑环及S4口袋的苯环与His41形成了“多重π-π堆积作用”。更值得一提的是，C5N17B并不与S1口袋中的关键氨基酸Glu166发生相互作用，这使得C5N17B能够避开Nirmatrelvir耐药性M^pro突变E166V的影响，为进一步开发广谱抗病毒药物提供了新思路和新见解。

图2. C5N17B（PDB ID：9G0I）与M^pro的共晶结合模式图，氢键以洋红色虚线表示；π-π堆积以绿色虚线表示。（B）C5N17B与His41的“多重π-π堆积作用”示意图。

抗病毒药物研发是涉及药物化学、病毒学、结构生物学、计算化学等不同学科的系统工程，特别是高级别生物安全实验室、突变及耐药病毒株是稀缺资源，相关领域研究者的优势互补、强强联合（图3）直接影响着整个研发的成功与否[13]。这项研究充分体现了国际合作的优势，并通过结构生物学、高通量合成和点击化学的方法的整合创新，快速筛选出具有潜在抗病毒活性的化合物，并且通过一系列实验验证了其抑制效果和作用机制，展现了其高效性和普适性，这对于加速抗病毒药物的发现具有重要意义。当前，该课题组正充分运用新一代点击化学或其它模块化反应建立超大型的小分子砌块库（图4），有望探索出高效发现和合成新型药物的新方法。

图3. 山东大学抗病毒药物化学团队研究人员访问韩国化学技术研究院传染病治疗研究中心并交流课题进展（2023年6月）

图4. 具有应用前景的模块化反应“化学工具箱”

山东大学硕士生杨娩玲、副研究员高升华、博士生宋乐天及韩国化学技术研究院传染病治疗研究中心博士生Myoung Kyu Lee为论文的共同第一作者。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、教育部长江学者奖励计划、山东省杰青、山东实验室项目等项目的资助。

文章链接：https://doi.org/10.1002/advs.202404884

参考文献：

[1] https://news.un.org/en/story/2024/08/1152866

[2] Song L, Gao S, Ye B, Yang M, Cheng Y, Kang D, Yi F, Sun JP, Menéndez-Arias L, Neyts J, Liu X, Zhan P. Medicinal chemistry strategies towards the development of non-covalent SARS-CoV-2 Mpro inhibitors. Acta Pharm Sin B. 2024;14(1):87-109.

本文编辑：左脑