临床治疗新技术：光遗传学不断制造惊喜
►光遗传学。来源：Mike Cohea, Brown University
编者按：
光遗传学从基础研究到临床应用不过短短十几年，在人类探索科学的漫漫长途中，这只是短暂的一瞬，但其从基础到临床的转化过程却非常迅速。在临床医学方面，光学调控已经显出其独特的优势：光对自然组织没有损伤，却可以根据遗传工程的设计，选择性地对神经细胞活动进行激活或调控。这为治疗多种神经、精神疾病带来曙光。虽然目前光遗传学还在早期临床试验阶段，其潜力却令很多领域的科学家兴奋不已。
撰文 | 周亮（赫尔辛基大学博士后）
责编 | 叶水送
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光遗传学（Optogenetics）从基础研究到临床应用的飞速发展打破了人们对技术发展曲线的常规观念。从基础到临床，光遗传学都显示出了无穷的活力和潜力，众多新技术、新设备和新想法不断涌现。
用光来控制神经细胞并不是本世纪全新的想法。早在1979年，DNA双螺旋的发现者之一、诺贝尔奖获得者弗朗西斯·克里克（Francis Crick）在《科学美国人》的一篇文章里就曾畅想，神经科学的发展需要一种新的工具，这种工具可以激活或者关闭特定的神经细胞，同时不影响其他的神经细胞。在这之后，他甚至还想出了一种特异性的控制方法：让细胞具有光敏感性[1]。当然，在当时的理论和实验基础下，科学家们还不足以实现这样的构想。
实际上利用光控制神经系统的想法，很多科学家一直在做，并开发出各种实用的工具。其中一种是把对光敏化学物质溶在神经组织周围的体液里，当光线照射时化学物质就会释放神经活性物质，这样就可以用光照的时间、亮度和照射位置来定时、定量、定位，控制神经线路，并由释放出的神经活性物质的性质，来确定控制的结果是兴奋还是抑制。
►光遗传学以及离子通道原理简图。来源：Brown University
从上个世纪中期开始，微电极逐渐成为神经科学研究的重要工具，它可以定点探测神经电信号和激活神经细胞。微电极是一种尖尖的针状电极，尖端的直径在0.1-100微米范围，可以用于记录或影响电极周围小范围的神经细胞：在记录时，它就像一只采访麦克风，只采集面前那个神经细胞的电信号，而不顾周围喧闹的环境；而在刺激时，微电极像个导播用的耳机，只把信号传给与它接近的神经细胞。利用微电极技术就可以直接用电激活一个或一小群神经细胞。通过激活神经细胞，可以推测这些神经细胞或者神经回路的功能。
微电极技术在1950-2000年期间，成为最精确的神经细胞操纵方式，然而却远非理想，主要因为以下两个问题：首先神经细胞有兴奋和抑制两类，就像汽车的油门和刹车。在脑组织中，这两类神经细胞混合在一起，在给予电刺激的时候可能兴奋抑制两种细胞都被激活，就像油门刹车一起踩，效果不清楚。因此当对一小群神经细胞进行刺激后，会观察到一些改变，但这些结果是哪一个或哪些神经细胞产生的，却不清楚；
第二个问题是，在任何一个大脑的功能电路中有上亿个神经细胞，用微电极激活的一个神经细胞或一小群神经细胞，所起的作用有限。当然人们可以加大电刺激以激活更多的神经细胞，但这必然也会带来靶点以外细胞的激活，产生更复杂甚至难以预料的结果。以上两个问题综合起来，就像在研究机器原理的时侯，只有锤子一样，砸的力量小时没任何作用，力量大可能产生相互抵制的作用（就像油门刹车一齐踩）；如果力量再大些，机器则不工作了，说不清到底是因为哪部分被破坏产生的效应。
因此，人们需要一种可以特异性地调控一批神经细胞的工具和方法，就像钳子改锥和扳子，可以用来特异地拆解某些零件。然而神经细胞很小，用于神经细胞的工具就要比钳子改锥和扳子更先进，要求能在显微尺度上自己到达需要研究的部位。遗传工程学手段可以满足这些苛刻的要求，把光敏蛋白装置到需要研究的细胞上，而利用光来控制光敏感蛋白分子，就能实现定时定量和定点控制的要求。光遗传学就是这么一门巧上加巧的技术。
下面我们来拆解光遗传学的两个关键技术。一是遗传工程：每个细胞都带着一份DNA蓝图，在生命的每一时刻，当细胞需要一些零件时，蓝图的一部分就被抄下，用于制造零件。遗传工程就是修改DNA蓝图的技术。如果你能篡改DNA蓝图，把一个对光敏感的蛋白分子设计图加进去，那么当这个设计图被细胞抄写，并执行时，就会自动造出对光敏感的蛋白分子，这样用光就可以直接控制细胞的活动。那么怎样篡改DNA蓝图呢？方法有很多，最传统的办法就是利用病毒。在生命进化过程中，病毒早已发明出DNA篡改术，可把宿主细胞的DNA切断，插进一段代码，这就类似用你的计算机（细胞）跑我的程序（病毒代码）。当然我们会事先拆解病毒，把有害的代码去掉，添上制造光敏蛋白的代码，当病毒感染神经细胞后，就会自动制造光敏蛋白了。除了病毒，科学家还在不断地开发更精确更高效的技术。比如，两位最近两位在基因编辑领域非常火的科学家——MIT的张锋和河北科技大学的韩春雨，分别开发了CRISPR和NgAgo技术，为切割DNA的精准刀锋带来了场及时春雨。（请参见《韩春雨：“一鸣惊人”的中国科学家发明世界一流新技术》一文）
第二个核心技术是光敏蛋白。这个也是纯天然有机物质。生物进化出了眼睛，从此世间有了阳光。光敏蛋白实际上是可以用光开关的离子通道。神经系统可以被看做是一个高度复杂的电路系统。其中每个神经细胞都像个小电池一样，静静地储蓄电能，然后利用电能处理及传输信号。蓄电的过程需要依靠细胞膜上镶嵌的几种蛋白分子，如“泵”和离子通道来进行。通过控制离子跨细胞膜的流量，来控制电荷的积累，产生静息态下的膜负电位。在静息时遇到神经递质等激活信号时，正离子通过通道蛋白进入细胞，导致细胞膜去极化；到达一定阈值时，将触发动作电位，钠离子快速内流，逆转细胞膜的电压，并沿着细胞膜、顺着轴突产生连锁反应，最终带来神经递质的释放，激活或抑制相邻的神经细胞。因此，电信号被用来传输神经信号和运算的介导。如果用光可以打开离子通道，就会让细胞外的正离子汹涌流入，改变了静息电位并引起动作电位。这样，光子虽小却可以四两拨千斤，激活神经细胞。（对“泵”、离子通道、静息和动作电位的介绍参见“知识分子”的前文《从磁场感受器说起:生物感受器的“四两拨千斤”》）。
当微生物的光敏离子通道（channelrhodopsin）ChR1和ChR2蛋白被发现之后，一些敏锐的神经科学家马上意识到，如果可以将这种通道蛋白用遗传工程的方法，转到神经细胞里，那么就可能通过光照来改变神经细胞的活性。
2005年，斯坦福大学的卡尔·德塞罗斯（Karl Deisseroth）和爱德华·博伊登（Edward Boyden）等人第一次将ChR2蛋白表达在了哺乳动物的神经细胞内，并发现蓝光可以准确地控制神经细胞的活动[2]。
此后，细菌视紫质（Bacteriorhodopsin）与盐细菌视紫红质（Halorhodopsin）都被顺利地表达于神经细胞中[3,4]。盐细菌视紫红质是一种副离子通道，当被光打开时大量氯离子涌入细胞，会降低静息电位，产生抑制作用。这样，人们可以通过不同的光来激活或抑制特定的神经细胞。随着光遗传学社区的无私分享与广泛合作，构建于光遗传学之上的材料和方法层出不穷，光遗传学技术迅速席卷整个神经科学领域。
光遗传学还是一项年轻的技术，谈临床应用似乎显得太早。但其实从诞生不久起，神经科学界对光遗传学应用于临床的探索就没有停止过。
例如2006年，美国韦恩州立大学华人科学家潘卓华教授（Zhuo-Hua Pan）实验室，将ChR2蛋白表达于感光细胞退化的小鼠视网膜神经节细胞内，使其获得了编码光信号的能力[5]。虽然这项研究并没有像德塞罗斯等人的研究那样给神经科学界带来重大革新，但其在光遗传学初始阶段就应用于治疗疾病，领先于他人。
作为一名视觉研究专家，潘卓华意识到眼睛可能是光遗传学最容易应用的区域，因为眼睛不仅是感光器官，对光的反应敏感，基因疗法在眼睛上比较容易操作，因为眼球直接暴露在体表。而且作为中枢神经系统的一部分，眼睛有一定的免疫豁免特性。同时也不需要能发出光线的额外硬件，因为眼睛就是暴露在光下的。随后，RetroSense Therapeutics公司与潘教授合作探索使用光遗传学临床治疗失明，并于2015年成功拿到了美国食品与药品监督管理局（FDA）的临床试验批准，可在视网膜色素变性的患者身上，测试基于光遗传学的治疗方法。
►视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa）。来源：gallery4share.com
视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa）是一种遗传性视网膜感光细胞退化疾病，与大约50多种基因突变有关，目前在全球约有150多万名患者。这些患者的视网膜上负责夜晚视觉的视杆感光细胞先死亡，负责白天视觉的视锥细胞随后死亡，使他们渐渐失去视觉。
目前，对于视网膜色素变性还没有有效的药物或手段进行康复性治疗，延缓感光细胞死亡进程治疗方法倒是有几种：第一种方法是将单克隆抗体Ranibizumab注射到眼睛里，每两周注射一次。它可以抑制血管内皮生长因子（VEGF），具备一定光感受器保护作用，但并不十分有效，第二种是针对基因RPE65突变造成视网膜色素变性的患者，Spark Therapeutics公司进行的基因疗法临床试验显示出不错的效果，但可治疗的人群范围太窄，而且对已经完全失明的人来说没有用。第三种方法是用仿生眼替换眼睛，目前的仿生眼技术还远远谈不上成熟，既昂贵又麻烦，还不美观，恢复的视力也非常弱。
RetroSense公司的光遗传学治疗，将含有光敏感通道DNA的病毒载体注射进入眼睛玻璃体中央，视网膜的最内层细胞——神经节细胞可被病毒所感染。一旦病毒载体将光敏感通道DNA介导进入神经节细胞，且神经节细胞开始制造光敏蛋白，它们就会在光线作用下被激活，也就是说，重新对外界光线起反应。RetroSense公司希望在视网膜上可以造出超过10万的光敏感细胞，使患者至少能看到桌子和椅子以及大一点的字母，而目前的仿真眼只能让患者一次获得几个像素的视觉信息。
2016年3月，RetroSense公司正式开始实施视网膜色素变性的光遗传学临床试验RST-001项目，并成功完成了第一例病人的实验，这也是世界上首例光遗传学临床治疗。这项临床研究共分为两部分，第一部分的目标在于决定实验所用试剂的浓度是否安全，患者是否耐受；第二部分将在最高剂量耐受组中获取更多的安全性数据，为今后的临床试验设计提供数据支持。
光遗传学有了第一例临床试验，接下来就会越来越多。除了视觉以外，还有许多其他神经系统疾病亟待治疗。
2010年成立的初创公司Circuit Therapeutics就计划将光遗传学应用于神经疾病的治疗中。第一步目标是慢性疼痛治疗，以取代那些需要脑深部刺激的疗法。因为受慢性疼痛影响的神经细胞就在脊髓外侧，比脑深部的神经细胞更容易接近，在早期的动物实验中，他们成功地将光敏感通道蛋白表达于痛觉相关的神经细胞中，并关闭了痛觉产生的通路。在注射含有光敏感通道蛋白DNA的病毒进入外周神经细胞的2周后，光敏通道蛋白就可以在其中稳定地表达。这种光敏感通道蛋白与治疗失明所用的蛋白不同，其效果刚好相反，用光照亮皮肤时，这种光敏感通道抑制了痛觉神经节细胞的活动，从而使痛觉感受和热敏感性显 著降低，而这两个问题正是最让慢性疼痛患者煎熬的问题。虽然人体试验尚未进行，但可以预测其成功的可能性很高。
与之类似，不少机构也在尝试用光遗传学治疗帕金森等更多的神经疾病。
►研究者通过小鼠的光遗传实验，研究如何降低人类的可卡因成瘾。来源：Nat Neurosci, 2016
光遗传学除了主导治疗之外，还可以作为一种辅助手段。
最近，意大利的一项临床试验在光遗传学的指导下，结合经颅磁刺激（Transcranial magnetic stimulation ，TMS）进行可卡因戒毒临床治疗[6]。由于之前有研究发现，“吸毒”大鼠的前边缘皮层（Prelimbic Cortex）活性降低，通过光刺激光敏感通道，激活这个区域后，寻找毒品的行为减少。于是这个意大利的临床试验就在人身上进行了探索，把光遗传学方法换成了更为无创的TMS。由于人脑的背外侧前额叶皮层（Dorsolateral Prefrontal Cortex，DLPFC）执行与大鼠前边缘皮层类似的功能，而且定位于人脑表面，易于TMS刺激，结果也令人振奋：69%的瘾君子，在TMS治疗期间没有复吸，而药物治疗的对照组这一比例只有19%。10个药物治疗组的患者，转入TMS组后，药物治疗时原本有8个复吸，经过TMS治疗后，只有3个复吸。单纯的药物治疗和脑部刺激经常带来脱靶效应（作用的靶点与期望的不一致），且精确度不高。与临床更可行的治疗方法相比，光遗传学和神经回路机制指导的治疗方案，会实现更好的效果[7]。
尽管光遗传学进展十分迅速，但仍处于发展阶段。在它的前十年中，相比神经细胞、突触等领域划时代的发现，光遗传学还没有为神经科学带来根本性的突破。光遗传学目前所做的事情只是让神经回路更易操纵，明确某些神经细胞对某神经回路的意义，或者是探索细胞类型与特定回路之间的关系[8]。
在临床应用中，光遗传学同样面临不少问题。从理论基础上看，我们对人脑细胞的类型只有很粗略的分类，这让治疗缺乏特异且明确的目标。对视网膜色素变性的治疗之所以能成为第一个光遗传学治疗研究，这与我们对视网膜细胞类型的精确了解是分不开的。
从技术层面上说，光遗传学也面临两个挑战，一方面是光敏蛋白基因的导入，无论是转基因还是病毒移植，如何有效地定位目标靶点，不触发人体的生理反应，如免疫反应等，如何让光敏蛋白基因在神经细胞中稳定、持续地表达，保证其长期的安全性，这些都是需要注意的问题；另一方面，则是如何安置光源，与视网膜不同的是，大多数神经细胞都在大脑深部，光源难以到达，如何让光源设备尽量小型化、可植入且易供电，是设备设计方面需要考虑的问题[9]。
随着美国、欧洲以及日本脑计划的实施，技术方面的难题正在逐步地解决。光遗传学社区一直以来的共享精神和快速发展的传统，相信会在短期内解决一系列光遗传学应用于临床的技术难题。未来会是怎样，谁也无法预计，也许到时候很多人身上都有小开关，开关神经细胞就像开关灯那样简单。
参考文献
1.Crick, Francis. "The impact of molecular biology on neuroscience." Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences 354.1392 (1999): 2021-2025.
2.Boyden, Edward S., et al. "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity." Nature neuroscience 8.9 (2005): 1263-1268.
3.Chow, Brian Y., et al. "High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps." Nature 463.7277 (2010): 98-102.
4.Zhang, Feng, et al. "Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry." Nature 446.7136 (2007): 633-639.
5.Bi, Anding, et al. "Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration." Neuron 50.1 (2006): 23-33.
6.Terraneo, Alberto, et al. "Transcranial magnetic stimulation of dorsolateral prefrontal cortex reduces cocaine use: A pilot study." European Neuropsychopharmacology (2015).
7.Ferenczi, Emily, and Karl Deisseroth. "Illuminating next-generation brain therapies." Nature neuroscience (2016).
8.Boyden, Edward S. "Optogenetics and the future of neuroscience." Nature neuroscience 18.9 (2015): 1200-1201.
9.Deisseroth, Karl. "Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience." Nature neuroscience 18.9 (2015): 1213-1225.
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