专访CRISPR发明人：基础研究也能带来创新性应用

立陶宛科学家Virginijus Šikšnys。http://lsveikata.lt

编者按

在基因编辑明星工具CRISPR的发明过程中，立陶宛科学家维吉尼亚斯·斯克斯尼斯（Virginijus Šikšnys）领导的一个研究组经常被忽略。

一直以来，美国加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德纳和德国马普协会感染生物学研究所的埃马纽埃尔·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）是媒体聚光灯下的中心。

直到2015年，博德研究所所长埃里克·兰德（Eric Lander）就CRISPR基因编辑技术的发明过程总结了一篇“CRISPR英雄谱”，斯克斯尼斯的工作被广泛了解。

2018年5月，斯克斯尼斯和杜德纳、卡彭蒂耶共同获得卡弗里纳米科学奖。

2018年9月，在挪威的卡弗里奖颁奖典礼上，斯克斯尼斯接受了《知识分子》的专访。

采访 | LING

翻译 | 王承志

责编 | 陈晓雪

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如何进入CRISPR领域

《知识分子》：感谢您接受我们的采访。我们想通过这次机会向中国读者讲述您和CRISPR的故事。可以和我们说说您是如何进入这个领域的吗？

斯克斯尼斯：我在立陶宛维尔纽斯大学工作。我多年来研究细菌的抗病毒免疫系统。抗病毒免疫在细菌中非常重要，因为细菌有个敌人——噬菌体。它就像细菌的寄生虫。噬菌体需要进入细菌才能复制。复制完成时，噬菌体通常会杀死细菌。细菌能够存活，是因为它们会构建多层防御，干扰噬菌体感染。

在我的实验室里，多年来我们使用X线结晶、生物物理和生物化学等多种手段研究细菌不同的抗病毒免疫系统。很长一段时间里，我们研究一些被称为限制性修饰系统的防御系统。这些限制性修饰系统通常作为细菌的第一道防线，它们由两种酶组成，限制性内切核酸酶和甲基化酶。限制性内切核酸酶识别入侵噬菌体DNA中的短核苷酸序列并切割DNA。而宿主DNA受甲基化酶保护，甲基化酶识别的序列被甲基化，从而使宿主DNA不被限制性内切酶切割。

因此限制性内切酶广泛用于分子生物学。多年来，我们想要了解它们如何实现独特的特异性，以及它们如何识别DNA中的短序列。我们觉得，如果我们理解了限制性内切酶如何实现其特异性的机制，也许就能够设计出可以靶向任何DNA序列的新限制酶。虽然我们发现了一些限制性内切酶识别特定序列的规律，但我们也意识到如果要改变这些酶识别的序列那需要做很多蛋白质工程的工作。因为它们的靶向机制是通过蛋白质和DNA相互作用实现的。而且即使你能够改变这些酶的特异性，大部分情况下它们识别DNA的能力比真的限制性内切酶也相距甚远。

所以，我对这些改造蛋白质的努力感到沮丧和厌倦，想找点新的事情干。2007年，《科学》发表了一篇文章，报道了细菌中一种叫做CRISPR的新的抗病毒免疫系统。我立刻对它产生了兴趣，我觉得我应该跳进去做点研究。

这篇文章里描述的抗病毒免疫系统来自于一种叫做嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的细菌，这种细菌通常用来生产奶酪和酸奶。我联系了这篇文章的作者，问他们是否可以提供菌株。我告诉他们我想研究这种细菌中的CRISPR系统，因为它抵御噬菌体的机制这和我现在正在研究的限制性内切酶系统很相似。但其分子机制还不清楚，我对CRISPR的分子机制的细节很感兴趣。他们很慷慨地寄给了我菌株。

但是就像我之前说的，这种细菌通常用来生产奶酪和酸奶，而我的实验室并不懂如何生产奶酪和酸奶（笑）。所以我们考虑把嗜热链球菌中的CRISPR系统转移到大肠杆菌中。每个人都熟悉大肠杆菌，而且大肠杆菌也是我们实验室干活的主力。

那么，问题来了。嗜热链球菌里有4种不同的CRISPR系统，一个显而易见的问题是我们的研究中该选哪一种。我们决定选择其中一个被称为CRISPR3的基因座进行研究，这有两个原因：一是这个基因座只有4个基因，所以这是个很小的系统。另一个原因是我们能够识别出其中一个基因的特征，我们相信这是限制性内切酶活性位点的特征。这一点很重要。

所以把这个CRISPR系统转移到了大肠杆菌里。让我们惊奇的是，这个系统在大肠杆菌中也能保护大肠杆菌免受噬菌体的攻击，如果这种噬菌体的基因序列在CRISPR区域有匹配的话。这是第一次证明了CRISPR系统是可以转移的，你可以把CRISPR系统从一种生物里转移到另一种生物里。这是个重要的发现，因为这证明它是有功能而且可以在物种间转移。所以下一步就是把这个系统转移到真核生物中。

所以显而易见，下一个工作就是要理解这个系统在大肠杆菌中是如何工作的。在大肠杆菌中，你有很多种遗传学工具可以使用，可以在CRISPR位点里一个一个地敲除基因，这样就能理解哪个基因对DNA干扰功能是重要的。我们发现只有Cas9对于DNA干扰是重要的。所以我们尝试从大肠杆菌里纯化Cas9蛋白。纯化以后我们发现了两种RNA分子。其中一种就叫做CRISPR RNA。事实上，我们展示了Cas9在这两种RNA分子的引导下，可以定位到入侵的DNA，并且Cas9可以产生导致DNA切割的双键断裂。所以到头来，Cas9和限制性内切酶一样，也是识别一个靶标DNA然后切割DNA。但有一个重要的不同，限制性内切酶识别DNA是使用蛋白质-DNA相互作用，而在CRISPR系统中，Cas9使用CRISPR RNA来识别靶标DNA，显然这让重新编辑配对的序列变得异常容易。你只需要改变CRISPR RNA，就可以把Cas9带到基因组上任何想靶向的序列。

这种易编辑的特性打开了基因编辑实验的大门，因为现在每个人都能编辑Cas9然后靶向基因组中任何序列。讽刺的是，我跳进CRISPR是因为我想避免再研究限制性酶，但再一次的，这其实也是一种限制性酶，不过从功能上来说使用完全不同的机制。所以我觉得非常非常有趣。当我们意识到Cas9的这种易编辑的特性，我觉得这为基因组编辑铺平了道路。所以这帮助我继续研究Cas9的分子机制。

当然，我们可能不是世界上唯一对CRISPR和Cas9感兴趣的课题组。事实上，确实有其它课题组也专注研究CRISPR和Cas9的分子机制。所以，这个领域就有了一定的竞争，不过这种竞争在科学界永远存在。

我们研究了Cas9工作的分子机制，然后当然我们决定把成果发表出去。我们首先把文章送到了《细胞》（Cell）杂志，三天后我们就收到了《细胞》的回信，说他们不感兴趣，他们甚至都没有送审。这个回应确实有点让人沮丧，因为我们相信这真的是一个重要发现。所以我们又把文章投到了《细胞报道》（Cell reports）。《细胞报道》也不喜欢这篇文章，也没有送审。所以我们只好做一些额外的工作把文章改成其它杂志的格式，最后决定把文章投到《美国科学院院刊》（PNAS）。过了一段时间，PNAS把文章送审了，但评审花了很久很久的时间。到了6月份，Jennifer课题组在《科学》（Science）上发表了那篇CRISPR的论文。结果她们成了最先发表这个成果的的课题组。虽然我们是最先投稿的实验室，但因为这个漫长的投稿过程而变慢了。她们的发表非常快，投到《科学》以后两个星期文章就被接受了。

从基础性研究到创新性应用

《知识分子》：这个投稿历程还是非常曲折的。

斯克斯尼斯：这就是我们的故事。不过我还是很高兴现在领域已经认可了我们的贡献。这也带来很大的影响。首先，我们得到了很多媒体的关注；其次，你得到了解释基础科研和基础研究重要性的机会，以及这些基础研究如何产生突破性的应用，就像在Cas9研究中发生的这样。我们从研究细菌的抗病毒免疫系统开始，尝试去理解细菌抵御噬菌体侵染最基础的机制，结果却转到了一种新的分子。但这在科学研究中是经常发生的。开始的时候，你做非常基础的研究，尝试去解答一些普遍的生物学问题，然后经常性地发现创新性的应用，并带来新的技术，就像基因组编辑一样。

《知识分子》：那下一步做些什么？

斯克斯尼斯：当然，正如你所见，Cas9被用到不同的模式生物中做基因编辑，Cas9也被用于不同的领域，从基础的生物学领域到生物技术到医学。但是，如果你回到细菌中，会发现仍然有很多抵御病毒的防御系统现在还没人知道是如何工作的。所以，研究细菌如何抵抗噬菌体仍然是很有趣的，可能你会发现里面藏着新的有用的工具，这就是科学发展的模式。

对CRISPR技术的态度将影响基础研究

《知识分子》：欧洲和美国对待基因编辑技术的态度似乎不同？

斯克斯尼斯：欧洲法院认为任何生物，使用了CRISPR和Cas9编辑技术，那么就可以被认定是转基因生物。但美国的判断完全不同。他们的监管部门认为CRISPR只是基因编辑的一种技术，不能认为使用了CRISPR编辑的生物都是转基因生物。这是由于两边对程序的看法不同。美国那边可能是看最后的结果。因为CRISPR可以精准地做编辑，所以你可以对基因组进行精确的操作，你完全知道你对生物做了什么。使用CRISPR技术得到了想要的作物，而且从结果上无法区分产物和用传统方法得到的作物有任何不同，比如传统的植物育种。而欧洲的看法则不同，他们更看重过程。你使用了基因编辑技术，更改了基因组，Cas9也是这种技术的一种，因此使用Cas9编辑的生物应该被看做转基因生物。这完全是两种不同的策略。

《知识分子》：所以你同意这是一种对技术的误解？

斯克斯尼斯：这是不同的策略，但欧洲的做法最后可能会有些问题，因为很难用相同的规则去套用不同的技术，因为如果技术改变了，那规则就无所适从。

《知识分子》：你认为这会对基础研究产生影响吗？

斯克斯尼斯：我觉得这些政策很可能对基础研究产生负面影响，尤其对欧洲的科学家。相比美国科学家来说，我们很可能错过一些重要的技术转化工作。（对于更多的影响，）我们将拭目以待。

《知识分子》：现在科学界、政策制定者和普通民众对转基因的态度已经有巨大的鸿沟。我们接触的每一个科学家几乎都会说转基因技术是安全可控的，而政策制定者通常持怀疑态度，而普通民众通常会说我不想尝试这个。你觉得问题出在什么地方？同样的事情出现在了CRISPR技术上，你作为一个科学家如何看待这件事？

斯克斯尼斯：正如你所说，科学家对转基因技术有清晰的看法，他们不认为这项技术有什么问题，因为他们理解技术背后的整个过程，也知道转基因生物是如何被创造出来的。显然我们已经有了足够长时间的观察，我们也没有发现转基因生物对健康和其它方面产生了任何影响。但是，对普通民众来说，他们觉得问题很大。我们需要科学界和科学家与普通民众更多的沟通。我们需要多站出来解释我们的工作，比如解释CRISPR技术是怎么一回事。正如我现在跟你的交流，可能我也是在和中国读者解释我们的工作。

《知识分子》：所以你觉得科学家，尤其是在这个领域工作的科学家，需要更直率的交流？

斯克斯尼斯：是的，可能需要这样，需要和大众以及媒体多交流。

《知识分子》：所以我们交流地越多，大众也会越接受？

斯克斯尼斯：没错，完全同意。当人们互相交流时，很多问题就消失了。许多话题包括转基因技术，都可以通过对话解决。

《知识分子》：非常谢谢您接受采访。

人物简介

维吉尼亚斯·斯克斯尼斯，立陶宛维尔纽斯大学教授。

1956年1月26日，斯克斯尼斯出生立陶宛北部的古老城市Šiauliai，并在那里长大。

在中学，斯克斯尼斯对数学，物理和化学很感兴趣，并参加了全国化学竞赛和一些国际赛事。之后，他进入维尔纽斯大学化学系，并对有机化学着了迷。1978年，斯克斯尼斯获维尔纽斯大学有机化学硕士学位。1983，他获得莫斯科国立大学酶动力学博士学位。回顾博士的学习，斯克斯尼斯认为，莫斯科国立大学当时可能是前苏联做博士研究的最佳场所，当时很多化学家转为生化学家，他们对化学反应的生物化学动力学和机制非常了解。

之后，他回到维尔纽斯大学应用酶学研究所做初级研究员（博士后）。1990年，立陶宛独立，也放开了更多的科学合作。抓住这次机会，斯克斯尼斯与布里斯托大学的Steven Halford等限制酶生化研究领域的专家合作。

1993年，斯克斯尼斯前往位于德国马克斯·普朗克生物化学研究所的Robert Huber（诺贝尔化学奖得主）实验室做访问学者。

1995年，他开始担任维尔纽斯大学生物技术研究所蛋白质-DNA相互作用部主任、主席科学家。过去是二十多年的时间里，斯克斯尼斯主要研究核酸代谢酶（限制性内切酶）的结构-功能关系。 2007年起，他开始研究CRISPR-Cas的机制，成为最先阐明Cas9蛋白可编程的DNA切割功能的科学家之一。

2016年，斯克斯尼斯与埃马纽埃尔·夏彭蒂耶、詹妮弗·A·杜德纳、Rodolphe Barrangou和Philippe Horvath共同获得沃伦·阿尔珀特奖（Warren Alpert Foundation Prize）。

2016年，他成为欧洲分子生物学组织（EMBO）成员。

 2018年，斯克斯尼斯与埃马纽埃尔·夏彭蒂耶、詹妮弗·A·杜德纳共同获得卡弗里纳米科学奖（Kavli Prize in Nanoscience）。

制版编辑 | 斯嘉丽

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