独家 | 事关下个诺贝尔奖：美国科学界激辩基因修饰技术英雄榜
Eric Lander（左）VS Jennifer Doudna（右）
编者按：
绝大部分科学家并非像宣传文章里说的不计名利，更不是有些人假扮的清心寡欲、高风亮节，而是很在乎功劳的归宿。
竞争是事实存在的，无须标榜“不争”以欺世盗名。只是，在中国这样的名利之争一般尽可能不公开，但这两天美国生物学界的激烈争论甚嚣尘上，部分争论公开了……就这次争议，《知识分子》独家采访了关键当事科学家。
从这样的事例中可以看到，国际科学界争论是文明争论，摆事实讲道理公开进行，不是捣浆糊，不是背后一堆告状信，更不是……我们需要清醒地认识到，何为竞争，如何竞争，怎样建立公平竞争的制度和环境？
文 | 陈晓雪 王承志 叶水送
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1月14日，国际三大学术期刊之一Cell杂志在线发表了麻省理工学院教授、Broad研究所所长Eric Lander一篇关于基因编辑技术CRISPR发现历史的综述，并介绍了这一技术发展重要节点上的科学家。
三天之后，加州大学伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna公开驳斥这篇文章。美国科学界关于CRISPR的纷争的讨论再次升温。
Eric Lander在Cell杂志上写了一篇关于CRISPR方面的综述，CRISPR技术的开拓者之一Doudna对此表示抗议，称介绍自己的“成就”存在“事实错误”。
在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的网站，她在这篇文章下面评论道，虽然Cell的编辑声称作者（Eric Lander）直接参与向相关的个人作了大量的事实核对，但是这篇文章对她实验室的研究以及与其他科学家互动的描述，“在事实上是错误的”，“作者没有核实（这些事实），而且文章在发表之前我并未同意”。
《麻省理工科技评论》高级编辑Antonio Regalado博士在Twitter公布了这段留言的真实性，他表示，通过邮件询问Doudna博士，PubMed的这段文字是否是她本人所写？Doudna回答，“是的，PubMed上的评论是我用自己的账户发的。请注意，我当时也试图在Cell网站发表相同的意见，但它没有被Cell的编辑接受。”
Regalado博士通过邮件证实了这段文字的真实性。
谁是CRISPR英雄？
2013年初，CRISPR技术被证实可以在活体真核生物中做到精确而有效的基因组编辑。此后，CRISPR技术给科学家带来了暴风骤雨般的改变，无论是在生物医学领域还是农业领域，成千上万个实验室开始使用并应用这一技术。
“我还不曾见过有分子生物学家还没有听说过CRISPR”，Eric Lander在文章开头写的CRISPR技术发展历程中的这一重要工作，虽然并未提及其在Broad研究所的同事、华裔科学家张锋是最主要的贡献者，但是在学界这并非什么秘密。
CRISPR技术的重要性，已是人尽皆知。实际上在此前的2012年，科学家们报道CRISPR-Cas9系统可以作为简单、灵活的基因组编辑工具，其中涉及的三位最重要的科学家正是Eric Lander这篇文章引起争议的主角。
到底谁是CRISPR的英雄？Eric Lander在这篇标题为“The Heroes of CRISPR”的文章试图给出答案。
在文章中，他刻画了一个CRISPR英雄谱，描述了一个由十几位科学家组成的、令人心潮澎湃的乐团，他们发现CRISPR系统，揭示出它的分子机制，并将其改造成强大的生物学研究和生物医学研究的工具。
Lander在文章中回顾道，CRISPR的故事始于西班牙阿利坎特省的白色海岸。1993年，西班牙科学家Francisco Mojica首先在嗜盐古细菌（Haloferax mediterranei）的基因组中发现了大约30个碱基对（bp）长度的回文重复序列，这些序列由36bp的间隔序列隔开。
经过生物信息学序列比对方法， Mojica发现，CRISPR序列中三分之二的间隔序列为病毒或外源质粒的序列，他意识到CRISPR系统与细菌的获得性免疫有关。
与此同时，法国科学家Gilles Vergnaud和俄国科学家Alexander Bolotin在2005年分别独立得到与Francisco Mojica类似的结论，即CRISPR与细菌的获得性免疫有关。
此后，Cas7和Cas9蛋白在CRISPR系统中的作用逐渐被揭示，科学家们发现CRISPR系统的底物是DNA，他们也证实核酸酶Cas9可以在crRNA的指导下对特定序列的DNA进行切割。
一个关键的里程碑
CRISPR系统被证实作为准确、高效的基因编辑工具，是科学家们发现CRISPR-Cas9系统的充分必要组分，包括Cas9核酸酶，crRNA以及tracrRNA。
Eric Lander认为，国际上有两个研究团队对这一里程碑式的发现做出了贡献。其一是立陶宛科学家Virginijus Siksnys和他的合作者。
Eric Lander在介绍Siksnys与合作者2011年、2012年的工作时评价道，“于是这个领域达到了一个关键的里程碑：CRISPR-Cas9干扰系统的充分必要组分，包括Cas9核酸酶，crRNA，以及tracrRNA现在已经知道了。这个系统被优雅的生物信息学、遗传学和分子生物学所解析。现在是在试管中进行精确的生物化学实验来确认以及扩展这个系统的时候了”。
另一个被Eric Lander提到的是Jennifer Doudna和法国生物学家Emmanuelle Charpentier（现在就职于德国柏林马克斯普朗克研究所和默奥大学）的团队。
“Charpentier和奥地利的同事从生化特性的角度对CRISPR开始了研究。在2011年5月，于波多黎哥召开的美国微生物学会的会议中，她做了关于tracrRNA的报告，并遇见了加利福尼亚大学伯克利分校的全球知名的结构学家和RNA学家——Jennifer Doudna。Doudna成长于夏威夷，并在哈佛攻读其博士学位，在此期间和Jack Szostak一起工作，研究设计一种将RNA自我剪切型内含子转化成具有复制RNA模版能力的核糖酶。之后她在科罗拉多大学做博士后，和Tom Cech一起工作，研究核糖酶的晶体结构。实验室成立之后（1994年在耶鲁大学工作，2002年之后在伯克利工作），她主要探索各种现象下RNA-蛋白复合物的特性，例如内源的核糖酶进入位点和microRNA的形成过程。她利用晶体学和低温电子显微镜来探索Type I CRISPR系统中串联复合物各组分的结构，而这些复杂的系统一般都被应用于微生物中，例如大肠杆菌。”
Eric Lander写道，“两位科学家决定强强联手。他们利用重组的Cas9(来源于大肠杆菌中表达的S. pyogenes Cas9)，以及体外表达的crRNA和tracrRAN。和Siksnys一样，他们也发现Cas9 能够在体外剪切纯化后的DNA，crRNA可以自由编辑，两个核酸酶功能域分别剪切两条链，以及crRNA和tracrRNA对Cas9而言都是必不可少的。此外，他们还发现当两个RNA融合在一个sgRNA上的时候，在体外同样也奏效。倘若这些sgRNA在体内也被证实能够有效的发挥作用的时候，sgRNA的概念将会被广泛的应用于基因组编辑中。”
值得注意的是，Eric Lander还详细介绍了两个团队投稿的过程。“Siksnys在2012年4月6日向Cell投递了他的文章。六天后，被杂志社直接拒绝。（事后，Cell的编辑表示这篇文章确实很重要。）Siksnys压缩了文稿，于5月21日投递到PNAS，并于同年9月4日才在线发表。而Charpentier和Doudna的文章相较而言进行地比较顺利，在Siksnys投稿两个月之后的6月8日，她们将文章投递到Science，并很快地通过审稿，于6月28日在线发表”。
“这两个团队均清晰地认识到生物技术的潜能，Siksnys表示这些发现将为通用的、可编辑的、RNA指导的人工核酸内切酶技术作铺垫，同时，Charpentier和Doudna也表示它在RNA指导的基因组编辑中具有很大的潜力。” Eric Lander总结说。
一石激起千层浪
Eric Lander的文章引起Doudna的强烈不满。她认为，作者对她实验室的研究以及与其他科学家的互动描述“在事实上是错误的”。
可是，具体到哪些事实是错误的，Doudna在PubMed上的评论并没有说明。在给《知识分子》的邮件回复中，Doudna说，“我和我的同事将在未来合适的时候进行回应。”
众所周知的是，Eric Lander所在的麻省理工学院Broad研究所和Jennifer Doudna所在的加州大学伯克利分校，正在为争夺CRISPR技术相关专利打得不可开交，CRISPR技术也被视为诺贝尔奖的热门领域。Eric Lander的文章发表之后，除了遭到Doudna的反驳指责之外，还遭受多位科学家的口诛笔伐。
一位不具署名的研究者在匿名同行评议网站PubPeer上表示，“对这篇文章中Eric Lander未能阐明其与CRISPR技术的利益冲突，我感到非常震惊和失望。他所领导的Broad研究所以及他曾发表的论文，在CRISPR技术专利上仍存在法律诉讼问题。Lander和Cell杂志的编辑需要阐明他们在本文中观点可能并不能让人们公正评价（CRISPR技术），此外缺乏利益冲突声明这一信息也是不合适的。事实上，如果是这样，这篇文章就根本不能发表。”
不过根据Eric Lander回复给《科学家》的声明，他已披露了“实际和可能产生的利益相关”，包括他所在的机构拥有CRISPR专利和专利申请。他还表示，他在12月中旬给Doudna发过邮件，请她对文章中的事实进行核实。
Cell杂志也回应道，作者已经声明并没有个人的财政利益相关，并声明他所在的机构Broad研究所、麻省理工学院和哈佛大学拥有与CRISPR相关的专利和专利申请。
同时，Cell在声明中指出，文章的平衡性、公平和准确是编辑和作者考虑的首要因素，同行审稿人会特别要求对（文章的）平衡和公平给出意见，他们提供的任何意见都会在修订版中体现。同时，作者直接向相关的科学家作了大量的事实核对。
在接受《科学家》采访时，Doudna表示，Lander确实在（2015年）12月18日联系过她，但他只分享文章节选的一部分。“他拒绝和我分享关于描述我实验室研究的更多内容，”Doudna在邮件中说。“我从来没有看到过完整的文章，直到出版，我有电子邮件来往可以证明。Lander博士应该给出提供意见的其他科学家名单。”
而Lander则认为，“她确认了她的个人背景信息，但是她说她不希望以任何形式对CRISPR技术发展的历史发表意见。在写这篇文章的过程中，我收到世界各地十余位科学家关于CRISPR发展的意见。不幸的是，Doudna博士是唯一一个拒绝的。然而，我充分尊重她不分享观点的决定。我也明白，会出现不同的观点。”
事实上，CRISPR“英雄榜”上的另一位科学家，曾与张锋在CRISPR研究上有过合作的哈佛大学遗传学家George Church, 对Lander这篇文章同样颇有微词。“（2015年）12月14日，Eric问了我一些非常具体的问题，我要求核实事实（我一般都会这么做）”，Church在给《科学家》的回复中写道，“他在1月13日发给了我预印版（Cell登出这篇文章几个小时前）。我马上发给他一个事实错误的清单，但没有一个改正。”
Church告诉《科学家》，“和Jennifer Doudna相比，我需要核实的信息是非常有限的。我在1月14日一大早就给Eric发了修改意见，但是这些在网上的文章中没有体现。（我于12月提供的）基本的事实核实本来可以早一些，文章也不会那么夸张。即使是现在，这些都不是很难解决，而且会带来很大的区别。”
Church争论的事实是，Lander写道，当Church的团队“着手在哺乳动物细胞中测试crRNA与tracrRNA融合”时，他意识到了 “张锋的工作”。此外，Church指出，“Prashant Mali和杨璐涵做了测试”，而不是他。
总的来说，Church说，“Eric的Cell文章有条理有步骤地遗漏了很多年轻研究者的重要作用。”
美著名科学作家Carl Zimmer第一时间声援Doudna，转发并关注这一事件。
美国著名科学作家Carl Zimmer也在第一时间关注了这一事件，并在Twitter上转发相关信息，为Doudna打抱不平。美国加州大学戴维斯分校（UCDAVIS）生物学家Paul Knoepfler甚至在Twitter上发起了一个名为“Lander教授是否给予Doudna教授公正的评价”的在线调查，在74人参加调查的数据统计显示，其中约有53%的人认为，Lander的这篇综述文章有失公正。不过，Zimmer并没有透露更多参与者的身份。
生物学家Paul Knoepfler在Twitter上做的一个在线调查，53%的人，认为Lander的这篇综述未能如实评价Doudna的贡献。
加州大学伯克利分校生物学家Michael Eisen在Twitter上写道，“最糟糕的（事实）扭曲是，Lander所有的CRISPR英雄都是研究负责人（PI），学生和博士后过去都干吗了？”
除了Lander成为众矢之的，在PubPeer网站上，很多匿名人士也将矛头指向了Cell杂志。一名不具姓名的人士表示，“实际上，我对此并不感到惊讶，Cell与哈佛和麻省理工学院的科研群体走得很近，Cell杂志就像是麻省理工学院的宣传期刊一样”。也有人说，“很难相信，这篇文章竟然出现在Cell杂志Scientific Perspective栏目上，我很想看评审专家的意见，以及他们如何让这篇不切实际的文章得以通过。”
就在本文发稿前3小时，北京时间1月20日上午6点，Charpentier在PubMed留言，“很遗憾，关于我和合作者的贡献的描述是不完整和不准确的。作者也没有问我要核实有关我或我实验室的语句。在作者提交该文之前，我没有看到关于它的任何一部分。而且，该杂志也没有将我纳入评审流程。”
《知识分子》将持续跟进这一争议的最新进展。
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附：Eric Lander总结的CRISPR英雄谱
[ 1993年 ] 西班牙科学家Francisco Mojica于1993年首先在嗜盐古细菌Haloferax mediterranei的基因组中发现了大约30个碱基对（bp）长度的回文重复序列，这些序列由36bp的间隔序列隔开。后来Francisco Mojica使用生物信息学方法在2000年左右在20种不同的微生物基因组内发现了类似的序列，但这些序列的作用当时并不知晓。
[ 2005年 ] Francisco Mojica经过生物信息学序列比对方法，发现CRISPR序列中三分之二的间隔序列为病毒或外源质粒的序列。他意识到CRISPR系统与细菌的获得性免疫有关。该结果于2005年发表于Journal of Molecular Evolution杂志上。
[ 2005年 ] 与此同时，法国科学家Gilles Vergnaud和俄国科学家Alexander Bolotin分别独立得到与Francisco Mojica类似的结论，即CRISPR与细菌的获得性免疫有关。二人的论文都于2005年发表于Microbiology杂志。
[ 2007年 ] 法国科学家Philippe Horvath和他的同事Rodolphe Barrangou以及Sylvain Moineau在研究生产酸奶的乳酸杆菌对噬菌体的抗性时，发现了Cas7和 Cas9蛋白在CRISPR中的作用：Cas7产生间隔和重复序列，Cas9则是核酸酶。
[ 2008年8月 ] 荷兰科学家John van der Oost通过生物化学方法鉴定了一系列Cas蛋白，并发现这些蛋白需要切割一段长为61碱基的前体RNA（crRNA）才能工作。他们证明了crRNA的作用，并通过人为设计相应的crRNA序列使菌株获得了抵抗噬菌体的特性。这是人类首次编辑CRISPR系统。
[ 2008年12月 ] 阿根廷科学家Luciano Marraffini和他的导师Erik Sontheimer（美国西北大学）证实了CRISPR系统的底物是DNA，并且意识到该系统可能可用于DNA编辑 。
[ 2010年12月 ] Sylvain Moineau证实了核酸酶Cas9可以在crRNA的指导下对特定序列的DNA进行切割 。
[ 2011年3月 ] 法国科学家Emmanuelle Charpentier 和德国科学家Jörg Vogel在研究微生物小RNA时意外发现一种含量极高的RNA（tracrRNA）正巧从CRIPSR位点旁边转录，并且序列可以与前体crRNA配对。他们发现tracrRNA对于crRNA的加工成熟是必须的 。
[ 2011年7月 ] 立陶宛科学家Virginijus Siksnys在大肠杆菌中重组了嗜热链球菌的CRISPR系统，证实了该系统至少需要Cas9核酸酶，crRNA和 tracrRNA三个组分。
[ 2011年 ] 2011年3月的一次微生物学会议上，Charpentier 遇到了加州大学伯克利分校教授Jennifer Doudna。二人讨论后决定合作，她们在体外重组了CRISPR系统，得到了与Virginijus Siksnys类似的结果。她们还发现crRNA 和 tracrRNA可以融合为一条RNA，称为单链引导RNA（sgRNA）。
[ 2012年 ] Virginijus Siksnys于2012年4月6日将手稿投递给Cell杂志，6天后该杂志通知其拒稿。Virginijus Siksnys与当年5月21日将该稿投给PNAS杂志并于9月4日在线发表。Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna于2012年6月8日将论文投与Science杂志，并于6月28日发表。
[ 2012年 ] 华裔科学家张锋（Feng Zhang）首次使用CRISPR系统实现了对哺乳动物细胞的DNA编辑。
更多链接：
https://pubpeer.com/publications/D400145518C0A557E9A79F7BB20294
https://liorpachter.wordpress.com/2016/01/18/the-heroes-of-crispr/
http://genotopia.scienceblog.com/573/a-whig-history-of-crispr/
梅月、陈慧乾对本文亦有贡献。
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