体外诊断试剂初期研发经验分享
依稀记得08年正式开始蛋白诊断试剂盒的研发，说实话，那时候更多的是彷徨、无助，胜于新鲜感。最大的原因在于实验设计经验基本为零，技术开发能力基本为零。或许后续的各位研友们有自己的理论知识和所谓的经验之道，但是，本人在此善意提醒一句，除非您已经真的从实践中形成了一套自有的研发思路，要么您拥有坚强的后盾导师，否则，请务必沉浸下来，好好的理清楚自己的思路。
很多新人进入单位，开始一个项目研发，或许都会跟我当初一样拥有迷茫感，那么请静心做好以下几个准备：
1.请先大量查阅文献，做到对该项目涉及的标志物特性了如指掌，比如说：该物质分子结构/空间结构，物理/化学性质；
2.该标志物在临床中的诊断意义，该标志物涉及的行业标准、产品标准等确立该标志物的基本性能指标等信息；
3.准备好以上资料并逐一理解之后，下面就开始研发工艺思路的设计。
针对3点，我举一个常规例子来说明：比如咱们开发某一蛋白标志物，如HCG（该标志物为目前很成熟的一种产品，技术门槛较低，抗体原料也很容易获得），在您已经准备好我所说的1.和2.之后已经知道该标志物为一个大分子物质，按照免疫学诊断方法学构造划分应使用双抗体夹心法，那么下一步我们就知道了，先去市场找该标志物的抗体原料，最好的是有原料商给您提供配对好的抗体对，为什么这么说？因为对于你所找到的抗体，若是单个的原料，下一步您就需要多一步骤，即抗体配对，特别是对于新入行的兄弟们，这块工作对于操作手法及配对方案的设计可能相对较为稚嫩，所以最好的就是让原料商帮你把这部分工作做好，也减少了您的研发周期，另外，从原料后期采购来说，对于原料商，您购买的品种和数量越多，给予您的折扣也相对理想，进一步可以降低试剂盒开发成本。当然，事无全是，具体情况还需具体分析。特此提醒：有一些新标志物产品特别是在刚上市之时，其实原料提供商真的很少，这个时候您就需要发挥极限能力，利用一切可利用资源，进行全球搜捕吧，哈哈，或许运气好可以找到，对此寻求到的原料也很少有配对原料提供，若此，那只能遗憾的跟您说，您准备着手做下原材料配对工作吧！原料配对里面涉及的内容太多，在此就不多叙说了，若有兴趣，咱们私下可慢聊。。。。。。
在此提醒各位研友，寻找的原料不能只有一家，至少需要找到3家以上，因为后面有一项很重要的工作需要你做，即：原材料筛选。最终获得的适合您技术平台的原料最好是为2家，一家以注册申报为主，另一家作为您产品后期的备份原料供应，这样对于后期上市产品供应的稳定性有很大帮助。毕竟现在企业的竞争都很激烈，说不得等您产品开发出来再回头去找该原料商发现已经不存在，那就糗大了。注意一点：在寻找原料时候必须是原料商提供的原料信息中原料适用平台里包含或者接近您的技术平台，这一点至关重要！
在您初步筛选出相对合适的原料后，那么下一步就是将该原料使用到您的技术平台上，若是单位的技术平台已经很成熟，那就按照企业的技术平台操作流程对应的一步步去匹配试用即可；若是新平台，那就要考虑几个问题，后期的各种不同标志物如何磨合进某一技术平台中，这个时候需要做的就不是去匹配技术平台，而是先各自按照一个大方向，大框架去独自产品开发。在您设定的操作步骤里，不乏以下几步：捕获抗体的包被（包被的介质如：ELISA板、化学发光板、磁微粒等）、识别抗体的标记（标记手法如：HRP/ALP酶促、HRP/ALP酶发光、吖啶酯/SA等化学发光物质、荧光物质等）、标准物质/质控品等购买/制备等，我说的这些是最基本的平台所涉及的。甚至有些平台涉及到放大系统（一般使用生物素放大系统较多）或者上转发光技术等等。说了这些，其实就是一个目的，在做产品前，先初步制定好自己的平台流程，对应的流程里涉及的试剂/物质，相应的去包被/标记/处理等。
做好以上的，那就开始您的正式研发工作吧，将您准备好的每一种物质带入某个制定步骤中，初期使用的抗体原料浓度一般有两种选择：第一种就是原料商给予的信息，建议浓度范围，您可以尝试；第二种就是常规的按照1ug/ml包被捕获抗体、1:2000稀释标记抗体，当然这些都是经验值，不适用于所有产品，具体产品还需要综合很多信息；比如我经历过的某些产品，对应的初步使用浓度一个为15ug/ml（EISPOT平台）、一个为3ug/ml（ELISA平台），这些是需要结合你所使用的平台特性以及原料物质本身特性决定，综合信息去考虑去衡定。甚至我做过的某产品原料用到了1mg/ml浓度（POCT平台），虽然浓度高，但单检测使用量少。。。。。。这里我就不多说了。
在您初步摸索过的浓度做了技术流程之后，你极有可能会遇到很多现象，比如：无数值（反应孔值与阴性孔值一致）或者全部高值（阴性孔与反应孔的数值一致都为很高的值），诸如此类问题的原因排查：
无数值，考虑所使用的buffer体系是否合理，孵育时间，洗板操作等等，导至蛋白在操作过程中丢失，还有一个问题需要重视，就是位阻问题，排查下使用的封闭系统是否存在导至位阻原因的大分子物质存在？另外在封闭体系和包被缓冲液中是否存在导至蛋白物质与反应介质去离子化物质？各反应体系缓冲液的pH值也是一个很重要的环节；
高值，考虑的几大方面包括：操作是否存在交叉污染？比如洗涤？比如加样使用枪头未更换？是否存在洗涤操作不彻底？是否存在洗涤液成分问题？等等。
在您基本摸索出反应浓度成梯度时（梯度计算可一次项直线计算、也可拟合各种曲线如：二次项、双对数等等，但是每种不同线性有对应的数据指标，可查阅相关资料），恭喜您，可以进入下一步操作，工艺优化，即：将您前期所操作的步骤，每一步骤，每一组份，去进一步精化操作，最终获得一个能够让您得到最优检测结果的所谓最优化操作步骤。这一大块，我也不累述了。很多细节是需要经验积累的。但是新手们，只需要记住一个准则：在确保自己操作手法的尽量标准外，每一环节做到大胆假设，小心求证即可。并且在研发工作期间，逐步积累经验，遇到细节问题多问多看，多翻阅相关资料文献，最终能够获得一个属于自己特色的研发思路和体系，而这才是您在研发之路走得更远更久的硬东西！
以上内容写的很乱很碎，只是粗略的谈下我本人对于研发初期的各位战友的一些想法，希望能够有点小用处。其实研发思路和自身研发体系，每个人都是各异的，一个产品的形成，需要研发技术、需要质量体系、需要法规约束等等，这是IVD产品的特色。质量体系也好，法规也罢，其实他们都是一个框架、一种约束，约束着产品技术的合理开发、临床的合理使用等，但是这仅仅是一个框架，实质内容还是需要研发人员去填补，至于如何将一个产品做到丰满有肉，那就需要各位研发大大们各显神通，而这也正是研发工作人员的目标。
来源：医疗器械质量与检测 / 编辑：弋水
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