【派森诺项目文章】当喀斯特地貌遇上土壤酸化，和尚洞微生态系统别有洞天！

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《Frontiers in Microbiology》

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最近，派森诺生物与中国地质大学合作，在《Frontiers in Microbiology》（最新影响因子：4.165）发表论文，揭示了喀斯特地貌的生态系统中，微生物群落组成的变化与土壤pH值以及土壤酸化之间的内在联系。

1.研究背景

喀斯特地貌，是具有溶蚀力的水对可溶性岩石（大多为石灰岩）进行溶蚀作用等所形成的地表和地下形态的总称，广泛分布于我国的云南、四川、重庆、贵州、湖南、湖北、广东、广西等多个省份。因此，我国是东亚重要的喀斯特地貌聚集区。然而，近年来，由人类频繁活动诱发的酸雨及亚热带季风气候引起的持续增强的降雨量，对我国的喀斯特地貌产生了显著影响，引发了包括土壤酸化在内的一系列改变，对生态和农业都造成了不良后果。

2.研究目的

目前对喀斯特地貌特征下的土壤样本已有不少研究，然而对喀斯特生态系统下的不同生境进行整合研究的案例相对匮乏。本研究旨在对具有典型喀斯特地貌特征的和尚洞生态系统中洞外洞内、自上而下的不同生境进行研究，旨在探究不同生境中的微生物群落组成与生境pH值等影响因素间的互作关系。

3.研究方法

测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台

测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V4区测序

实验对象：湖北省长阳县具有喀斯特地貌特征的和尚洞内外的土壤样本和水样本

实验设计：和尚洞外，分别采集4份被森林覆盖的山顶土壤（MT）、3份农田土壤（FL）、3份洞顶土壤（CT）；在洞内，在靠近洞口的明亮处、洞中部的昏暗处、和洞内不透光的黑暗处分别采集表面沉积物样本（SP、SD、SA）各3份、风化的碳酸岩样本（WP、WD、WA）各3份；在洞中部昏暗处收集1份水滴样本（DW3），在洞内黑暗处收集2份水滴样本（DW1、DW2）。

4.研究结果

，碳酸盐基岩及酸雨在中国的地域分布；，酸雨对可溶性碳酸盐基岩的溶蚀作用模型；C和D，中国湖北省和尚洞地貌纵切面图解以及洞内外取样点示意图。

对和尚洞中采集的样品进行分析发现，除了4个山顶土壤（MT）之外的其他样本均为微碱性，pH值介于7.28-8.35之间。水滴样本（DW）中的TOC含量最低，而来源于山顶（MT）和洞上方（CT）的洞外土壤样本及洞内明亮处的风化碳酸盐岩石样本（WP）中的TOC含量较高。在样本DW、MT、FL中未检测到NH₄⁺，而在CT中有NH₄⁺存在。大多数样本中NO₃^-的含量比NO₂^-高，CT除外。在所有固体样本中，硫酸盐的含量均比较相似，介于0.11-0.57 mM之间。水滴样本中的NO₃^-和SO4^2-含量比大多数固体样本更高。

对31份样品的微生物组成进行高通量测序发现，在门水平，Proteobacteria和Actinobacteria的丰度在几乎所有样本中都是最优势的。如Proteobacteria在风化岩石样本WA1、WA2、WA3、WD3及山顶土壤样本MT1、MT2、MT3中的占比为20-40%，在水滴样本中的占比甚至超过60%。而Verrucomicrobia和Acidobacteria在固体样本中的含量比在水滴样本中要高。

结合聚类分析的丰度最优势的前10个门的组成分布热图

进一步分析显示，Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria在碱性土壤中更占优势。Actinobacteria在所有的风化碳酸盐岩石样品及表面沉积物样品SD1和SD3中丰度较高（40%-60%）。在Proteobacteria门中，Alphaproteobacteria在酸性土壤和高TOC含量的碳酸盐岩石样本中的丰度最高，而在低TOC含量的水滴样本和碱性沉积物中含量较低。在低TOC含量的样本中，Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的含量较高。

和尚洞不同生境中Proteobacteria门中不同物种的相对丰度分布

同时，Alpha多样性分析显示，洞中表面沉积物样本的菌群多样性程度最高，而水滴样本最低。

和尚洞不同生境中的微生物群落多样性

基于OTU的进一步分析表明，属于OTU_13的Pseudonocardiales（Actinobacteria）和属于OTU_22的Solirubrobacterales（Actinobacteria），在风化的碳酸盐岩石中相对丰度较高。而属于Chthoniobacterales（Verrucomicrobia）的OTU_47在洞外土壤样本CT和MT中相对丰度较高。在水滴样本中丰度最高的为属于Moraxellaceae（Gammaproteobacteria）的OTU_54。

和尚洞不同生境样本中相对丰度≥2%的OTU聚类分析热图

基于Unifrac距离的加权PCoA主坐标分析显示，洞外表面覆盖土壤样本MT、FL、CT和洞内明亮及黑暗处的表面沉积物样本SP、SA具有相似的菌群组成结构；风化的碳酸盐岩石样本和洞内昏暗处表面沉积物样本SD较为相似；而水滴样本的菌群组成结构较为独特，与其它样本差异明显。

和尚洞不同生境样本基于Unifrac距离的加权PCoA主坐标分析

而LEfSe分析进一步显示，不同的喀斯特地貌生境样本的关键物种组成从门到属均具有显著差异。Actinobacteria在碳酸盐岩石样本（WA、WD、WP）中占有显著优势。Acidobacteria（18.85%）、Verrucomicrobia（12.9%）、Planctomycetes（9.9%）、Alphaproteobacteria（55%）和Deltaproteobacteria（20%）在洞外的表层覆盖土壤样本（MT、FL、CT）中普遍存在。而在洞内表面沉积物样本（SA、SD、SP）中占比较大的为Chloroflexi（9.97%）、Nitrospirae（7.19%）、Gemmatimonadetes （4.61%） 以及Firmicutes（3.53%）。Proteobacteria（尤其是Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria）在水滴样本（SW）中占有优势。而在属水平上，Crossiella、Euzebya和Rubrobacter在碳酸盐岩石样本（WA、WD、WP）中占有优势；Bradyrhizobium和Acidothermus在洞外的表层覆盖土壤样本中占据优势；Gaiella在洞内表面沉积物样本占据优势；Sediminibacterium、Brevundimonas、Acidovorax、Hydrogenophaga、Polaromonas、Acinetobacter、Perlucidibac和Pseudomonas在水滴样本中占据优势。

LEfSe分析显示不同生境下的显著差异物种分布特征。属水平字母简称依次代表：A，Crossiella；B，Euzebya；C，Rubrobacter；D，Bradyrhizobium；E，Acidothermus；F，Gaiella；G，Sediminibacterium；H，Brevundimonas；I，Acidovorax；J，Hydrogenophaga；K，Polaromonas；L，Acinetobacter；M，Perlucidibaca；N，Pseudomonas。

本研究的另一个亮点在于，采集了不同生境样本的12种环境参数，并通过RDA分析衡量这些影响因素与和尚洞生态系统中微生物组成结构之间的相互关系。结果显示，在门水平，pH值（物种组成多样性贡献率为14.9%，P = 0.03）、TOC（9.8%，P = 0.022）和K⁺浓度（7.1%，P = 0.03）是与物种组成结构联系最为紧密的三种环境因子。在纲水平，对Proteobacteria门下物种进行RDA分析所能解释的信息量占比为53%，其中pH值和TOC占28.6%。不同门水平的物种组成结构与pH、、的相关性不尽相同。在不同生境的样本中，随着pH值的增加，Acidobacteria、Verrucomicrobia和Planctomycetes的相对丰度显著减少；而在酸性样本中，Gemmatimonadetes和Firmicutes的相对丰度较高。pH值越高，Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria的相对丰度越高。Acidobacteria、Verrucomicrobia和Planctomycetes的相对丰度和样本中的TOC含量呈正相关。农田土壤样本（FL）、大多数洞内沉积物样本及水滴样本的菌群组成结构与pH值呈正相关，与TOC和K⁺浓度呈负相关。在洞内风化岩石样本中，只有Actinobacteria与K⁺浓度呈正相关。通过对洞外表层土壤样本OTU水平的Shannon多样性指数与pH值之间进行线性回归分析发现，两者之间具有较强的相关性。

不同环境参数对不同生境下菌群组成结构影响的RDA分析。A和B，所有生境样本门水平的RDA分析；C，所有生境样本Proteobacteria门下纲水平的RDA分析；D，洞外表层土壤样本（MT、FL、CT）门水平的RDA分析。

洞外表层土壤样本OTU水平的Shannon多样性指数与pH值之间的线性回归分析

5.总结

本研究表明，由酸雨和持续增强的季风性降雨导致的土壤酸化，使得包括洞外表层土壤、洞内沉积物、洞内风化的碳酸盐岩石及落下的水滴在内的整个喀斯特生态系统的细菌菌群组成发生了显著变化。这一变化主要与各生境中pH值、TOC和K⁺浓度改变有关，这些环境因素对喀斯特地貌不同生境的细菌菌群多样性和物种组成具有显著影响。

本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

文章索引

Yun Y, Wang H, Man B, Xiang X, Zhou J, Qiu X, Duan Y and Engel AS (2016) The Relationship between pH and Bacterial Communities in a Single Karst Ecosystem and Its Implication for Soil Acidification. Front. Microbiol. 7:1955. doi: 10.3389/fmicb.2016.01955

文案  微生物组事业部

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