【好文共赏】一管窥豹，SOP标准化在宏基因组研究中的重要性

    宏基因组，特别是16S宏基因组已经被广泛采纳进中国微生物研究人员的工作内容中，然而绝大多数研究者只是将样本DNA直接提供给测序公司，自己并不承担建库和测序的过程。这种委托方式的普遍泛滥，有着极大的隐患——实验方案不可控！

    不同的公司有其自身的技术特点和成本考量，进行16S宏基因组测序的实验方案不尽相同。测序平台的选择（Miseq、Ion torrent或454），测序量的选择（3万read 或5万tag），测序区域（V1~V3或V3~V4），建库方法（一步法建库或两步法建库），建库过程中所使用的酶（Taq酶或Q5）、扩增循环数等等，太多的技术细节隐藏在实验流程中，不亲身操作很难了解。每一处细节的变动都将对结果产生极大的影响。下面，我们从一篇文献（相似的文章有很多）简单的看看影响到底有哪些：

1、建库方法的区别

一步法建库是指通过一轮PCR反应，同时进行16S扩增和接头连接的工作，如下图a所示。

两步法建库是指通过两轮PCR反应，分别进行16S扩增以及接头连接的工作，如下图b所示。

利用两种方法，分别对预混有20种细菌的标准品进行建库及高通量测序，如图所示，一步法建库会造成某些菌的假阴性结果（如图d），定量结果也与实际结果相差较远（图c）。两步法建库的结果准确性（图e图f）明显优于一步法建库。

碎碎念：由于一步法时间短、成本低，目前被很多公司用于作为建库手段。但是从准确度的角度，笔者严重不推荐！

2、建库中所使用的酶会造成实验结果很大的偏差

该文章中的Fig1g、Figure2~5详细讨论了不同酶应用在建库中对测序错误error、杂合read、菌群结构等各方面的影响。

这里不一一展示，只放一张Figure5a，大家可以看到采用不同酶处理同样的样本，菌群聚类区别很大。

直接说结论吧：Kapa>Q5>Tag  建议在建库实验中采用Kapa高保真酶！

文中用Tag酶得到的结果真的只能用“呵呵”二字来形容了。

碎碎念：酶的价格和质量真是成正比啊。大家委托测序很少会关注用什么酶吧。

3、样本起始浓度和建库循环数

如Figure4图所示，样本起始浓度越高，建库循环数越大，实验结果与真实情况偏差越远。

再次碎碎念：随着测序价格的下降，测序仪越来越普及了，再也不是什么远在天边的技术。笔者强烈建议，为了结果的可靠和可比性，大家能自己测序最好自己测，能自己建库最好自己建！实在不行要委托公司建库测序，也最好只委托一家，不要来回换，不然不同公司间的技术差异甚至会超过你样本间的差异。

最后碎碎念：

基于宏基因组的微生物检测实验技术的标准化很重要！

    基于宏基因组的微生物检测实验技术的标准化很重要！

        基于宏基因组的微生物检测实验技术的标准化很重要！

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