JACS | 伊利诺伊大学陆艺|高强度聚焦超声时空控制DNAzyme探针体内成像

以高时空分辨率检测体内金属离子对于了解金属离子在机体健康和疾病状态中的作用至关重要。尽管先前的研究者们已经采用上转换纳米粒子等功能材料通过光信号成功实现了对金属离子传感器的时空控制，但由于在组织和体内层面缺乏穿透深度，限制了其应用。为此，伊利诺伊大学香槟分校化学系陆艺教授团队利用高强度聚焦超声 (HIFU) 透过深部组织提供具有时空分辨性的热能从而激活体内和活细胞内的脱氧核酶（DNAzyme），开发了一种用于体内活细胞内金属离子检测的传感器，该成果发表在国际化学顶级期刊JACS上，题目为“Noninvasive and Spatiotemporal Control of DNAzyme-Based Imaging of Metal Ions In Vivo Using High-Intensity Focused Ultrasound”。在该项研究中，Zn²⁺选择性DNAzyme探针预先被保护链灭活以抑制催化结构的活性，然后通过高强度聚焦超声诱导的局部温度升高来激活。通过这种设计，新的DNAzyme-HIFU探针在HeLa细胞和小鼠中都证明了能够通过荧光共振能量转移 (FRET)实现Zn²⁺的特异性成像。该方法还可用于监测许多其他金属离子，进而实现相关疾病的体内成像和医学诊断。

共同通讯作者：陆艺，King C. Li

共同第一作者：Xiaojing Wang，Gun Kim，James L. Chu

脱氧核酶（DNAzyme）是一种具有酶活性的DNA分子，是一类重要的金属离子传感器。与其他金属离子探针相比，可以通过体外筛选获得具有高金属离子选择性的脱氧核酶。在过去的几十年中，基于 DNAzyme 的传感器已被报道用于检测许多金属离子（例如Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和 Cd²⁺等），并且其应用与功能仍在扩展中。在本研究设计中（如图1所示），研究者选择了对于Zn²⁺具有特异性响应的8−17 DNAzyme作为概念证明（细胞和体内应用中研究最充分、使用最广泛的DNAzyme，并且Zn²⁺在生物系统中起着重要作用，包括蛋白质功能调节等，锌离子的失调也与前列腺癌有关）。在该研究设计中，DNAzyme通过保护链（P）与酶链（E）之间的杂交而失活，因此在引入HIFU之前，DNAzyme处于失活状态。而在HIFU处理后产生大量热量，将局部温度从37°C提高到43°C，导致P−E之间解链（研究者选择将局部温度提高到43°C，因为这是小鼠轻度热疗的温度上限，并已用于药物输送）。进而，E链又与底物链杂交，形成具有活性的DNA酶构象。同时，在系统中加入辅助链（H），以消除HIFU刺激后的游离P链。在Zn²⁺存在的情况下，S链被E链切割。由于切割产物的熔化温度较低（27°C），因此在生理温度下可以从E链释放出来，从而产生可检测的信号。

图1：使用高强度聚焦超声对基于脱氧核酶的体内金属离子成像系统进行无创化时空控制示意图

作者首先验证了该传感器的可行性。该传感器包含了两个部分：第一部分是包含底物链、酶链和保护链的三链结构；第二部分是辅助链。正常温度或者低于体内温度37度时，第一部分的三链结构是稳定存在的。只有当使用HIFU对探针进行作用使温度达到43度时，保护链与酶链解杂交，与此同时酶链和底物链形成更加稳定的激活态的DNAzyme探针。30分钟以后，撤去HIFU，温度降低至37度，此时释放出的保护链会与第二部分的辅助链杂交形成双链，由于之后温度不会再上升，因此该双链会稳定存在。为了监测该传感器工作的每个步骤。如图2所示，研究者使用了双荧光基团Cy3和Cy5。失活状态下的DNAzyme的荧光基团被猝灭，所以在514 nm的波长激发下没有明显的荧光信号。当HIFU作用时，激活态的DNAzyme探针则可以产生荧光共振能量转移（FRET），产生Cy5荧光信号。而金属离子Zn²⁺存在时，底物链被切断并由于熔融温度的改变，含有猝灭基团的短链会被释放出来。此时使用相同的514 nm波长的激发会产生明显的Cy3荧光信号。

图2：DNAzyme-HIFU体系可行性验证

 (a)热处理前体系荧光波长图；(b)在43°C热处理30 min后体系荧光波长图；(c)在37°C加入锌离子30 min时，DNA探针和辅助链的荧光响应图。

在验证了DNAzyme-HIFU探针的设计可行性后，研究者通过动力学参数对其性能进行了评价，如图3所示。可以发现，随着时间延长，荧光信号的改变与实验设计一致。而且，随着Zn²⁺浓度增大，FRET比率(FA/FD)与Zn²⁺浓度呈线性关系，检测限(LOD)计算为345 nM。

图3：DNAzyme-HIFU体系动力学参数验证

(a)在37°C和43°C热处理前后探针稳定性的动力学曲线;（b）热处理后添加锌离子引起荧光信号变化的动力学曲线; (C)热处理后探针的Zn²⁺浓度依赖性响应图；(d)探针对不同Zn²⁺浓度的响应曲线;(e)FA/FD(=FI666nm/FI565nm)与Zn²⁺浓度的校正曲线；(f)探针在HIFU激活下的荧光响应(λex=514nm)

接下来作者研究了探针在活细胞和小鼠中的传感性能（如图4和图5所示），在不添加Zn²⁺的情况下，在HIFU处理之前在HeLa细胞中观察到最小的荧光信号。HIFU超声处理后，Cy3信号增加，Cy5/Cy3之间的FRET比率增强。增强的FRET比率表明在细胞内形成了活性DNAzyme，这与体外研究一致。新形成的DNAzyme可以与内源性的Zn²⁺反应并产生Cy3信号。结果表明DNAzyme系统可以在HIFU控制下实现细胞内锌离子的监测。与体外和细胞实验相比，小鼠体内的热传导和DNAzyme反应可能较慢。超声作用30分钟后，小鼠左侧显示的信号是作为对照组的右侧的1.91倍，这表明通过HIFU超声激活的DNAzyme被分解。此外，60分钟后，观察到经HIFU处理的侧翼的荧光增加了2.42倍。为了进一步验证传感器可以用于检测小鼠体内的内源性金属离子，进行了只使用探针和不使用额外金属离子的空白对照。在相同条件下，由HIFU时空释放的声能声激励的侧翼显示出增强的荧光信号，表明了该传感器在监测体内微环境金属离子方面的稳健性。

图4：DNAzyme-HIFU体系在细胞内传感性能的验证

 (a)（b）(c)对HeLa细胞内的内源性Zn²⁺检测激光共聚焦成像(对荧光强度进行量化计算Cy3和Cy5的FRET比值); (d)附加外源性40μM Zn²⁺后的细胞激光共聚焦成像和(e)相应的Cy3信号强度分析

图5:DNAzyme-HIFU体系在小鼠体内进行金属离子传感的性能验证

(a)分别从小鼠左面和右面（探针和40μmZn²⁺注入）示意图；(b)对小鼠超声前；(c)超声后25 min;(d)超声后30min的荧光信号成像图；(e)小鼠注射探针和Zn²⁺后全身荧光显像柱状统计图。

综上所述，该研究通过设计一种三链DNA探针和辅助链，同时引入高强度聚焦超声实现了DNAzyme探针的远程时空控制，并成功应用于检测和成像活细胞和小鼠体内的Zn²⁺。这种基于脱氧核酶的探针的无创和高时空控制的技术拓宽了脱氧核酶在金属离子检测中的应用，使其成为体内金属离子成像的有力工具。

通讯作者简介

陆艺教授，1986年获得北京大学化学系学士学位，1992年获得University of California (Los Angeles) 博士学位，1994年起在美国伊利诺斯大学Urbana-Champaign分校任教，现任Jay and Ann Schenck教授。目前研究领域涉及生物无机化学及其在生物医学工程、环境工程、化学工程等方面的应用，在金属蛋白的设计与工程、酶催化工程、DNA和RNA的结构和活性等方面开展了深入研究，并将相关研究成果应用于生物传感器、环境工程等领域，取得了卓有成效的成果。在Nature、Science、PNAS、Adv. Mater.、Angew. Chem. Int. Ed、J. Am. Chem. Soc.等国际著名学术刊物发表250余篇论文，拥有20多项美国及国际专利，其部分成果成功地实现了商业转化。曾获得美国国家自然科学基金会特别创新奖（前美国总统青年奖）、Camille Dreyfus Teacher-Scholar、Howard Hughes Medical Institute 教授奖。

King C. Li教授，医学博士，工商管理硕士，现任教于伊利诺伊大学医学院，著名分子影像和放射学家、教育家、发明家。拥有16项专利，以及4项新的发明申请，在知识产权开发和商业化方面，以及大型临床转化研究项目的建立和管理方面有着诸多成就。

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撰稿/排版：陈恒屹 张冲

审核：罗阳 杨纪春 王康