肿瘤转移是指癌细胞通过血液或淋巴从原发肿瘤部位扩散到机体其他部位的复杂过程。具体地说，癌细胞参与的转移级联是通过包括最初获得侵袭表型、局部侵袭、转运到远处器官、外渗和侵入外来组织实质、在继发性部位生存以及最终适应和增殖几个连续的过程实现的。因此，开发有效的抗转移策略来阻断原发性肿瘤的传播，并通过靶向转移级联的早期阶段来防止转移的形成十分必要。为此，武汉大学刘晓庆和王富安课题组在ACS Nano上发表了题为“Multifunctional DNAzyme-Anchored Metal−OrganicFramework for Efficient Suppression of Tumor Metastasis”的研究论文。本文构建了一种基于Fe/Mn的金属有机框架材料，用来搭载具有高催化切割活性的特定DNAzyme，该DNAzyme能特异性沉默与肿瘤转移相关的Twist mRNA，从而有效地抑制肿瘤细胞侵袭，同时联合化学动力学疗法和光热疗法来有效抑制肿瘤细胞的生长。
共同通讯作者：刘晓庆、王富安
第一作者：赵芸
研究人员构建了基于Fe/Mn离子的金属有机框架(FMM)，将其搭载具有高催化切割活性的特定DNAzyme，其可以保护DNAzyme在体循环中免受生物降解，一旦被癌细胞摄取，FMM纳米球被H+/谷胱甘肽(GSH)激活，同时释放Mn2+离子作为DNAzyme必不可少的辅因子，在Mn2+的作用下，DNAzyme就可以切割Twist mRNA，实现基因治疗。此外，Fe2+离子作为Fenton反应的主要参与离子，通过催化细胞内过氧化氢(H2O2)生成细胞毒性羟基自由基(·OH)来介导高效化学动力学治疗(CDT)（图1)。高效的基因/化学动力学联合治疗是通过DNAzyme辅因子和有效的谷胱甘肽消耗来实现的。借助FMM纳米载体的光热转换性能，该联合治疗策略可在光热刺激下进一步促进Fenton反应，并通过有效的基因治疗加速Twist DNAzyme的释放。Mn2+离子通过催化裂解Twist mRNA(转移相关基因)促进基因治疗(GT)，而Fe2+离子通过Fenton反应催化细胞内过氧化氢(H2O2)生成细胞毒性羟基自由基(·OH)来介导高效化学动力学治疗(CDT)。因此，该体系可在光热/磁共振成像引导下同时实现肿瘤的有效消除和转移的阻断。
图1.多功能DNAzyme锚定金属有机框架通过细胞内信号级联的联合调节协同抑制肿瘤转移的有机框架。
首先，研究人员对FMM纳米粒子进行了表征，FMM是基于Fe3+和Mn2+与2,5-二羟基对苯二甲酸(DHTP)的羧基之间的配位相互作用合成的。扫描电镜显示制备的FMM纳米粒子呈现银耳状纳米结构（图2B），其流体动力学直径约为233 nm，将Twist基因靶向DNAzyme物理吸附到FMM表面后，尺寸增加到268 nm左右（图2C）。zeta电位显示负载DNAzyme后电势变得更小，这可能是DNA链上的负电荷造成的。接着，研究人员通过将不同浓度的FMM与Cy5标记的DNAzyme共孵育来评估FMM纳米粒子对DNAzyme的负载效率。结果显示，Cy5-DNAzyme的荧光强度随着FMM纳米粒子浓度的增加而逐渐猝灭，从而计算出1 mg/mL的FMM可吸附1 μM 的DNAzyme（图2D电泳图插图）。其次，研究人员通过XPS证实了FMM@Dz纳米杂化体中Fe(III)、Fe(II)、Mn(IV)和Mn(II)元素的存在（图2E、F）。随后研究人员对FMM负载DNAzyme的光热转换能力进行了评估。结果表明，随着FMM@Dz浓度增高，温度明显升高，升温范围主要在25℃-52℃。
图2.DNAzyme封装纳米板的负载能力和光热性能的表征(FMM@Dz)。（A）FMM支架制备示意图；(B)FMM纳米片的SEM图像；(C) FMM和FMM@Dz的大小和zeta电位；(D) Cy5-DNAzyme在不同浓度FMM存在下的荧光强度(665 nm)。插图:游离DNAzyme (1 μM)聚丙烯酰胺凝胶电泳(第二道)和FMM (1 mg/ mL)和DNAzyme (1 μM)混合物上清(第一道)；(E,F) FMM@Dz的Fe (E)和Mn (F) X射线光电子能谱（XPS）；(G,H)不同浓度的FMM@Dz随时间变化的温度和光热图；(I)808 nm激光照射下，FMM@Dz连续光照射开/关5个周期的温度变化。
接着，研究人员对FMM@Dz的体外pH/GSH响应特性和·OH生成能力进行评估。Fe2+的检测是通过与菲咯啉 (Phe)形成有色菲咯啉-Fe2+产物来评估的。FMM@Dz具有内在的pH/GSH可控分解特性，在pH 5.5下，大量的Fe2+和Mn2+在GSH作用下从FMM@DZ释放。FMM@Dz释放的Fe2+可用于CDT治疗；同时，FMM@Dz释放的Mn2+和DNAzyme通过靶向和沉默Twist基因用于基因沉默。此外，为了证实FMM的光热转换效应可以加速DNAzyme的释放，研究人员对FMM@Dz进行了不同的光辐照时间（0、4、8 分钟）照射，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 对释放的DNAzyme进行量化（图3G）。结果显示，释放的DNAzyme随着光辐照时间的延长而增加，并进一步探讨了DNAzyme的切割效率，结果表明，FMM@Dz在其底物上的切割效率呈剂量依赖性增加(图3H)。
图3.FMM@Dz的pH/GSH响应特性、ROS生成、DNAzyme释放和活性评估。(A)光热增强·OH生成示意图;(B) FMM@Dz在不同pH/GSH条件下Fe2+的释放曲线;(C) 在不同pH/GSH条件下，用原子吸收光谱法测定FMM@Dz在24小时内的Fe2+和Mn2+释放(D) 不同浓度FMM@Dz下的谷胱甘肽耗竭，由谷胱甘肽指示剂（DTNB）和谷胱甘肽对产物的吸收表明;(E)不同处理的TMB溶液的紫外可见吸收光谱;(F)在pH 5.5、37℃和100 μM H2O2条件下，10分钟后，不同浓度FMM@Dz的吸收光谱变化;(G) PAGE表征DNAzyme在pH 5.5磷酸盐缓冲液中不同光照射时间下的释放;(H)PAGE表征FMM@Dz释放的DNAzyme的裂解效率。
接下来，研究人员对细胞摄取FMM@Dz及胞内GSH的消耗和·OH生成进行了评估，采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术研究4T1细胞对FMM@Dz的摄取。如图4A−C所示，FMM@Cy5-Dz处理后4T1细胞的荧光信号随着孵育时间的延长而增加，表明FMM@Dz纳米粒子具有很强的内化能力。然后通过细胞内GSH实验探究FMM@Dz的GSH耗尽能力。结果显示FMM@Dz可明显降低4T1细胞的GSH含量。接着采用2，7 -二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定4T1细胞中ROS含量，DCFH-DA可被细胞内的ROS氧化，产生高荧光的DCF产物。DCF的荧光强度与活细胞内ROS浓度成正比。流式细胞仪分析(图4E)和荧光成像结果(图4F)显示，FMM处理的4T1细胞由于Fenton反应产生·OH，荧光较弱。而FMM@Dz处理后4T1细胞内ROS高于FMM组，这可能与Twist的抗氧化活性有关。
图4.评估细胞摄取FMM@Dz, FMM@Dz-mediated细胞内GSH的消耗和生成的·OH 。(A、B) FMM@Cy5-Dz处理不同时间后4T1细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像(A)和流式细胞术分析(B)；(C)通过流式细胞术实验获得4T1细胞的平均荧光强度(MFI)；(D)用FMM@Dz耗尽细胞内GSH；(E,F)式细胞术检测不同处理下4T1细胞内·OH水平(E) (I, control; II,laser; III,FMM; IV, FMM@Dz; V, FMM@Dz+laser) 和Cytation 5荧光细胞成像(F)。
Twist是一种协调EMT（上皮间质转化）的转录因子，有助于肿瘤细胞的侵袭和转移。通过Twist靶向DNAzyme可下调Twist基因的表达，用于抗肿瘤细胞转移。研究人员首先对4T1细胞进行转移和迁移性评估。伤口愈合实验结果表明，完整细胞在24小时后显示出最高的伤口愈合率，表明4T1细胞的转移特征。FMM@Dz的基因调控作用通过qRT-PCR进行研究。FMM@Dz释放的Twist DNAzyme与Mn2+可以有效地切割Twist mRNA。光辐照的FMM@Dz显示出最低的Twist mRNA表达。在光辐照的FMM@Dz组中观察到68.9%的Twist蛋白下调。综上所述，Twist DNAzyme可同时下调基因和蛋白质从而抑制癌细胞转移。
图5.FMM@Dz体外抑制转移和调节基因/蛋白表达能力的评价。(A、B)不同处理下4T1细胞的伤口愈合图和伤口愈合率定量分析；(C、D) Transwell（基质侵袭）实验图及不同处理后侵袭细胞图和细胞数量分析；(E)不同处理的4T1细胞Twist mRNA的qRT-PCR；(F)对4T1细胞经48 h处理后的Twist蛋白进行Western blot分析，并定量分析归一化后的Twist蛋白表达；(G) FMM@Dz基因/蛋白调控的分子机制示意图。
为了评估FMM@Dz的治疗效果，研究人员每3天给4T1荷瘤小鼠静脉注射不同的药物。与PBS和光辐照对照相比，FMM组减缓了肿瘤的生长，表明FMM的有效CDT。FMM@Dz组的肿瘤生长速度慢于FMM，表明CDT和GT的联合治疗效果优于单独CDT治疗。激光照射后，FMM+激光组的肿瘤生长进一步受到抑制，表明光热疗法和激光增强化学动力学疗法均有助于抑制肿瘤的生长。光照射的FMM@Dz组观察到肿瘤生长被抑制显著，这归因于CDT/GT/PTT的组合治疗效果。此外，不同治疗组的肿瘤切片H&E染色和TUNEL显示，FMM@Dz+激光组细胞大量凋亡。
图6.FMM@Dz对原位4T1乳腺癌模型的体内治疗效果。(A) 4T1荷瘤小鼠的治疗示意图；(B)不同处理下小鼠肿瘤体积曲线；(C、D)各组切除肿瘤重量照片；(E) 4T1荷瘤小鼠肿瘤组织H&E染色；(F)肿瘤组织TUNEL染色病理改变。
最后，研究人员探讨了FMM@Dz在体内的抑制转移作用，取肺组织进行转移结节的统计分析和H&E染色。结果表明，光照射后FMM@Dz组显示出对肺转移的最有效的抑制，这可以通过更小的转移区域(图7A，B)和最小的转移结节数量(图7C)证明。接着通过qRT-PCR实验研究不同处理后Twist基因的沉默效率。结果表明，FMM对降低的mRNA表达没有明显的贡献，额外的光照射可以增强基因沉默，使得Twist mRNA的表达降低40%。这些结果与Twist蛋白的表达一致(图7E)。
图7.FMM@Dz的体内抗转移性评估。(A、B)不同处理下4T1肿瘤小鼠肺的H&E染色图像和代表性图片；(C)不同处理的4T1肿瘤小鼠肺转移结节统计学分析；(D) qRT-PCR分析不同治疗方法对4T1荷瘤小鼠肿瘤Twist mRNA表达的影响；(E、F) Western blot分析不同处理的4T1荷瘤小鼠肿瘤中的Twist蛋白及定量统计分析。
综上所述，作者开发了一种多功能的FMM@Dz纳米平台，该平台可递送DNAzyme以联合基因治疗、化学动力学治疗和光热治疗治疗转移性乳腺癌。FMM@Dz具有良好的光热转换能力，不仅加速了Fenton反应，而且加速了Twist DNAzyme的释放。通过化动力疗法和热消融疗法杀死肿瘤细胞，并通过光热加速释放TwistDNAzyme下调Twist蛋白的表达，从而抑制肿瘤的肺转移。体外和体内研究证明了FMM@Dz的优异的治疗效果和生物安全性，是一种自给自足和自我增强的转移性癌症治疗纳米体系。
通讯作者简介
刘晓庆，武汉大学化学与分子科学学院，教授，博士生导师。2009年初于中科院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室获博士学位。2009至2015年先后在丹麦奥胡斯大学化学系、交叉学科纳米中心，以色列耶路撒冷希伯来大学化学研究所、纳米科学与技术中心工作。2015年加入武汉大学化学与分子科学学院，任教授、博士生导师。曾获中科院刘永龄特等奖，入选国家级人才项目。研究方向包括分析化学方法、生物医学材料等。主要围绕核酸分子的组装与调控，开发先进材料与探针，用于传感分析检测、精准诊疗研究。相关成果发表在Angew.Chem.Int.Ed., Nat.Commun., ACS Nano, Nano Lett., Acc. Chem. Res., Adv. Mater., Adv. Funct. Mater., Biomaterials, Chem. Sci., Anal. Chem.等国际一流期刊100余篇并被广泛引用，授权专利6项。
王富安，武汉大学化学与分子科学学院，教授，博士生导师。2003年和2009年分别于郑州大学化学系和中科院长春应化所获得学士和博士学位。2009年至2014年在以色列希伯来大学从事博士后研究。2014年起在武汉大学化学与分子科学学院开展独立研究工作。主要从事生物纳米复合材料与智能医学诊疗等研究，致力于开发肿瘤早期诊疗新方法、核酸信号扩增和多功能核酸纳米药物；在活细胞和活体内高灵敏度成像研究领域积累了丰富的经验，取得了一些进展和系统性、原创成果。截至目前，在相关领域国际权威学术期刊发表论文110余篇（包括34篇通讯作者论文和20篇一作论文，其中影响因子大于9的27篇），一作及通讯作者论文包括1篇Chem. Rev.，1篇Matter，4篇J. Am. Chem. Soc.，6篇Angew. Chem. Int. Ed.，2篇ACS Nano，1篇Nano lett.，1篇Nucleic Acids Res.，1篇Nat. Commun.，1篇Adv. Mater.，6篇Chem. Sci.，3篇Small，8篇Anal. Chem.等。其中SCI高被引论文8篇，发表论文获得引用七千余次，H因子41。主持国家自然科学基金3项，申请并获批美国及中国专利各一项，参与编写关于核酸纳米机器和核酸信号扩增反应的书目章节三个。
参考文献：
Yun Zhao, Ruomeng Li, Junlin Sun, ZhiqiaoZou, Fuan Wang, and Xiaoqing Liu, Multifunctional DNAzyme-AnchoredMetal–Organic Framework for Efficient Suppression of Tumor Metastasis.ACSNano 2022 16 (4), 5404-5417.
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c09880
撰稿/排版：汪梓宁 齐林芝
审核：罗阳 杨纪春 王晓辉