Nano Lett.|四川大学华西医学中心应斌武/曹钰|基于无酶平行杂交链反应的破伤风类毒素均相二元视觉荧光检测

破伤风是一种威胁生命的疾病，其主要症状是肌肉僵硬和痉挛、痉挛性瘫痪、呼吸障碍和自主神经功能障碍。破伤风每年导致约100万人死亡，平均病死率为20-30%。破伤风感染的潜伏期通常为7-8天，但最短仅需24小时。尽管死亡率及治疗成本高，但目前尚无直接检测破伤风抗原的商业试剂盒。目前临床诊断主要依赖酶联免疫吸附试验（ELISA）间接检测破伤风抗体，不仅操作繁琐，且受患者免疫功能好坏的影响。对于感染性疾病，最为理想的体外诊断方式是直接对抗原进行检测。破伤风类毒素是一种外毒素，其通过阻断抑制性神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸的释放而导致破伤风。由于早期临床阶段难以采集感染样本以及现有临床方法的敏感性不足，对破伤风类毒素这种检测方法的报告很少。因此，迫切需要开发一种快速、灵敏、准确的破伤风抗原检测方法。为此，四川大学华西医学中心应斌武课题组在Nano Lett.上发表了题为“Homogeneous Binary Visual and Fluorescence Detection of Tetanus Toxoid in Clinical Samples Based on Enzyme-Free Parallel Hybrid Chain Reaction”的研究论文。本文通过整合破伤风识别适配体（Aptamer）和杂交链式反应（HCR）与基于硒化镉量子点（CdTe, QDs）的阳离子交换反应（CER）进行信号放大，开发一种用于直接检测破伤风类毒素的灵敏POCT分析方法，该方法能够检测浓度低至0.25 fg/mL的破伤风类毒素，也可通过直接观察试管中的颜色变化或读取喷墨打印测试条上的迁移距离来实现二进制视觉读数。

第一作者：陈飘飘，白云金，唐时元

通讯作者：应斌武，曹钰

图1：无酶三平行HCR和选择性CER辅助破伤风类毒素二元可视化分析示意图

如原理图所示，检测系统由A2-P4-P5-P6和六个DNA发夹（H1-H6）组成。当靶标（破伤风类毒素）存在时，它与适配体结合，导致A2-P4-P5-P6的dsDNA解离，随后释放P4、P5和P6链。游离P4、P5和P6分别与H1和H2、H3和H4、H5和H6触发HCR反应，形成P4-（H1-H2）n、P5-（H3-H4）n和P6-（H5-H6）n三种HCR产物。进一步，该方法加入了含有二价铜离子的CuSO₄和具有还原性的抗坏血酸（AA），依赖HCR生成的长双链DNA作为模板生成铜纳米粒子（Cu NPs），Cu NPs被激发后产生的荧光信号作为输出检测信号，从而定量检测破伤风类毒素。当CdTe QDs添加到系统中时，与喷墨打印技术进一步集成，创建便携式阅读测试条。当试纸条浸入反应溶液中，毛细管作用将其穿过表面，溶液中的Cu²⁺通过CER淬灭QDs的荧光。因此，试纸条上荧光减少的长度与Cu²⁺浓度成正比。在类毒素存在的情况下，反应混合物中形成更长的dsDNA，用更少的游离Cu²⁺可以生成更多的Cu NPs，因此条带显示出更短的距离。这将导致溶液的荧光和颜色更亮，并且测试条上的移动距离更短。因此，我们将我们的策略称为破伤风类毒素的三平行HCR辅助二元视觉和荧光均质分析。

图2：（A）：QDs选择性识别不同模板Cu NPs和Cu²⁺的验证示意图；（B、E、H）：QDs识别Cu²⁺和Cu NPs（插图为紫外线灯下的照片）后产生荧光柱状图；（C，F，I）：分别以（AT）10，（AT）15和T30为模板时，不同浓度DNA模板下Cu NPs的荧光信号；（D，G，J）分别以（AT）10，（AT）15和T30为模板时，不同DNA模板浓度下QDs的荧光信号。（监测Cu NPs或QDs的荧光信号的激发波长分别为340 nm或365 nm。误差条来源于三次重复测量）

如图2所示，该研究首先对CER的可行性和参数条件进行了优化，以进一步提高分析性能。作者选择了（AT）10、（AT）15和T30链作为合成Cu NPs的模板。不同DNA模板合成的Cu NPs均在330 nm处出现特征紫外吸收峰，600 nm-700 nm范围内出现荧光发射峰，证明对Cu NPs激发后产生的发射峰强度进行检测可以作为体系的输出信号。另一方面，由于Cu²⁺可以有效地诱导QDs聚集形成CuTe，而在模板DNA存在下形成Cu NPs可以抑制这种反应，也可以产生可识别输出信号。实验结果表明，当模板DNA的量发生变化时，QDs的荧光信号也相应变化（图2B、E、H）。除荧光外，还可通过在紫外光下肉眼读取溶液颜色或喷墨打印测试条距离的变化来检测QDs对Cu²⁺和Cu NPs的不同响应（图2B、E、H插图）。当模板DNA浓度发生变化时，以QDs被用作信号报告物时，低DNA模板浓度下的信号变化比Cu NPs作信号报告物时更为明显，表明QDs对DNA模板变化更为敏感（分别图2D、G、J与C、F、I）。

图3：（A、D、G）：以A1-P1-P2、A1-A1-P3和A2-P4-P5-P6作为识别转换元件的无后续核酸扩增反应的破伤风类毒素检测示意图；（B、E、H）：使用QDs作为信号报告器的比色视觉读数结果图；（C，F，I）：分别使用三种信号转换元件采用QDs作为信号报告物时，荧光信号强度和破伤风类毒素浓度之间的线性关系。（监测QDs的荧光信号的激发波长为365 nm，误差条来源于三次重复测量）

接着，作者将QDs对Cu²⁺的选择性反应与基于适配体的识别结合起来，用于检测破伤风类毒素。经查阅文献和收集整理，作者发现破伤风类毒素有两种适配体，包括一种32个碱基长度的适配体1和一种70个碱基长度的适配体2。作者使用以上两种适配体作为识别元件，分别设计了三种类型的DNA组合，作为破伤风类毒素分析的三种不同检测模式（图3A、D、G）。在每种模式下，通过使用A1-P1-P2、A1-A1-P3或A2-P4-P5-P6作为dsDNA模板合成Cu NPs。在破伤风类毒素存在的情况下，与适配体结合，对应的dsDNA模板双链结构被破坏，使得合成的铜纳米粒子减少，QDs的CER水平增高。在优化条件下，所有三种检测模式都取得了良好的分析性能。研究发现，当使用Cu NPs作为信号报告物时，无论采用直接读取还是试纸条读取检测，该方法的最低检测限（LOD）都仅能达到ng/mL。而当采用QDs作为信号报告物时，我们发现使用A1-A1-P3和A2-P4-P5-P6的识别报告组合比使用A1-P1-P2作为分析报告的组合更敏感，其荧光和视觉读数的LOD均为1 pg/mL（图3B、C、E、F、H、I）。因此，实验结果表明，采用A2-P4-P5-P6识别元件作为识别探针，QDs作为检测探针的策略可以用于破伤风类毒素的敏感检测。

图4:（A）：用于破伤风类毒素分析的方法可行性验证的DNA凝胶电泳；（B）：使用Cu NPs作为信号报告物时的荧光信号；（C）：使用QDs作为信号报告物时的荧光信号（插图为荧光读取和试纸条读取的照片）；（D，E）：当Cu NPs为信号报告物时，荧光光谱和荧光强度与破伤风类毒素的量关系；（F，G）：当QDs为信号报告者时，荧光光谱和荧光强度与破伤风类毒素的量关系；（H，I）以QDs作为信号报告剂时，不同类毒素浓度下溶液颜色和试纸条距离的可视化结果图。（监测Cu NPs或QDs的荧光信号的激发波长分别为340 nm或365 nm。误差条来源于三次重复测量）

作者进一步发现，用无核酸扩增适体策略分析破伤风类毒素的最低检测限仅略低于毒素的LD100（2.5 ng/kg）。因此，有必要进一步提高检测灵敏度，以更好地协助临床用于破伤风感染的早期诊断。鉴于A2-P4-P5-P6对破伤风类毒素最敏感，因此被选为模板HCR反应的识别启动元件。如原理图所示，检测系统由A2-P4-P5-P6和六个DNA发夹（H1-H6）组成。当靶标存在时，它与适配体分解的A2-P4P5-P6 dsDNA模板结合。然后释放P4、P5和P6链。游离P4、P5和P6分别与H1和H2、H3和H4、H5和H6触发HCR反应，形成P4-（H1-H2）n、P5-（H3-H4）n和P6-（H5-H6）n三种HCR产物。进一步，该方法加入了含有Cu²⁺的CuSO₄和具有还原性的抗坏血酸（AA），依赖HCR生成的长双链DNA作为模板生成Cu NPs，Cu NPs被激发后产生的荧光信号可以作为输出检测信号，从而定量检测破伤风类毒素。当CdTe QDs添加到系统中时，与喷墨打印技术进一步集成，以创建便携式阅读测试条。当试纸条浸入反应溶液中，毛细管作用将其穿过表面，溶液中的Cu²⁺通过CER淬灭QDs的荧光。因此，试纸条上荧光减少的长度与Cu²⁺浓度成正比。在类毒素存在的情况下，反应混合物中可以形成更长的dsDNA，用更少的游离Cu²⁺可以生成更多的Cu NPs，因此条带显示出更短的距离。这将导致溶液的荧光和颜色更亮，并且测试条上的移动距离更短。研究者通过琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱分析对可行性进行了验证（图4A-C），并进一步研究了HCR辅助策略对类毒素的定量能力。在0.1 pg/mL至10 ng/mL的浓度范围内，直接使用Cu NPs作为荧光报告物导致与浓度对数呈线性关系（Y=17 log C+13，R²=0.993，图4D，E），LOD达到0.03 pg/mL。当QDs被用作信号报告物时，该方法的灵敏度进一步提高，可在1 fg/mL至1 ng/mL范围内检测到，LOD为0.25 fg/mL（图4F，G）。以10 fg/mL靶标的相对标准偏差（RSD）表示的再现性为3.8%（n=5）。在上述条件下，测定并比较了不同目标浓度的溶液颜色和试纸条距离。当破伤风类毒素浓度增加时，观察到荧光强度增加的溶液，低至10 fg/mL的类毒素可以通过视觉进行识别（图4H）。相比之下，测试条上的距离测定显示出比颜色读数更好的灵敏度，低至1 fg/mL的破伤风类毒素浓度可通过目视测定（图4I）。与已报道的抗原和IgG抗体检测方法相比，该方法在灵敏度方面具有优势，并可通过视觉进行直接分析测定。因此，引入无酶HCR扩增和基于QDs的选择性CER大大提高了检测灵敏度，为下一步早期破伤风感染患者的临床血清验证奠定了理论基础。

图5:（A）：用该研究所提出的策略分析临床患者和健康血清样本破伤风类毒素的结果及诊断数据；（B）：用临床ELISA破伤风抗体检测试剂盒分析结果及诊断数据；（C）：临床抗体试剂盒和该研究所提出的策略分析临床样本结果的一致性对比；（D）：3例破伤风患者注射破伤风抗毒素注射后7天内，采用该研究所提出的策略检测患者血清类毒素水平的变化结果图；（E）：24份临床患者血清样本破伤风类毒素试纸条检测结果图

最后，研究者通过对临床血清样本中破伤风类毒素浓度进行测定，验证了该方法的临床实用性。图5A显示了45例临床破伤风阳性和15例阴性样本的测试结果。结果显示，阳性患者血清中的破伤风类毒素浓度均高于5 fg/mL，阴性患者的血清低于5 fg/mL。因此，本研究构建的荧光分析策略在样本中破伤风类毒素的定量结果与IgG抗体的定量结果之间具有良好的一致性，其中以0.1 IU/mL（0.3 μg/mL）的浓度作为临床临界值（图5B，C）。使用该方法的测试结果与标准临床诊断完全一致，证实了该方法用于临床分析的准确性。实验结果还表明，使用该方法诊断破伤风感染的临界值为5 fg/mL。随后，作者试图通过监测注射破伤风抗毒素后破伤风感染患者的血清破伤风类毒素水平在7天内随时间的变化，以探索该方法能否用于破伤风治疗的辅助监测。研究结果发现，三名不同程度感染破伤风患者的血清浓度在1-7天内逐渐下降，这与临床数据一致（图5D）。以上结果表明，该方法也为破伤风的治疗监测和预防药物过度使用提供了新的可能。

综上所述，该研究开发了一种简单、高灵敏度、成本效益高的同质检测方法，用于检测临床样本中的破伤风类毒素，该方法具有双重荧光读取模式和二元视觉读数方式。适配体与基于QDs的CER、dsDNA模板化Cu NPs以及三重平行HCR有机整合，使得使用荧光读数检测、比色读数检测以及试纸条距离变化检测破伤风类毒素的LOD分别为0.25 fg/mL、10 fg/mL和1 fg/mL。同时，该研究选取了84例破伤风类毒素临床样本进行验证，定量结果与临床诊断高度一致，显示出100%的特异性和敏感性。此外，基于试纸条的检测方式的临床实用性也通过24例临床样本的测试被充分验证。通过该方法检测破伤风类毒素的检测限5 fg/mL被确定为破伤风感染的临界值。然而，该方法也具有一定的局限性，例如在确保高灵敏度的同时，相应孵育反应时间也较长。总之，该方法为破伤风感染的临床诊断以及社区医院和家庭的破伤风诊断监测提供了新的解决方案。

通讯作者简介

应斌武，教授，博士研究生导师。四川大学华西医院实验医学科主任/四川大学华西临床医学院医学检验系主任。成都华西精准医学产业技术研究院有限公司总经理。中华医学会检验专委会第十届委员会委员，中华医学会检验专委会临床免疫学组委员，中国医师协会第四届检验医师分会常委委员，世界华人检验与病理医师协会委员，中国中西医结合学会第一届检验医学专委会常委，中华检验医学教育学院四川分院院长，中国医师协会毕业后医学教育检验医学科专业委员会委员，中国医药生物技术协会实验室生物安全专委会副主委，中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会副主任委员，第十二批四川省学术和技术带头人，第十二批四川省卫生计生委学术技术带头人，四川省医师协会第二届检验医师分会会长，四川省医学会第十一届临床检验专委会候任主委，四川省高级职称评审委员会专家，担任《检验医学与临床》杂志副主编，《中国循证医学杂志》、《中华检验医学杂志》、《国际检验杂志》、《中国输血杂志》、《临床检验杂志》、《临床化学（中文版）》等编委，第三届国之名医（青年新锐）获得者，四川大学优秀青年学者基金获得者，四川大学五粮春优秀青年教师奖获得者。

曹钰，主任医师，博士研究生导师。中华医学会急诊医学专委会副主任委员、人文学组组长，中国医师协会急诊医师分会副会长，中国急诊专科医联体副主席，四川省医学会急诊医学专委会候任主任委员，四川省医师协会急诊医师分会候任主任委员，第十一批四川省学术和技术带头人。获“全国医德楷模”、首届“四川省新时代健康卫士”、“四川名医”、“四川省卫生计生委领军人才”、“四川省急诊医学学科带头人"等荣誉称号和四川省医学科技一等奖、四川省教学成果一等奖、成都市科学技术进步二等奖等奖项。1995年四川医科大学毕业留校工作至今，长期从事急诊医学和灾难医学的医疗、教学、科研、管理工作，主要研究方向为急危重症、急性中毒、灾难医学等。2006年在美国Thomas Jefferson University Hospitali进修急诊管理与临床，同时开展部分科研项目。先后主持国家级、省部级课题20余项。参编/译国家级规划教材与专著38部，申请发明专利8项。近五年，以第一作者或通讯作者发表学术论文87篇，其中SCI论文41篇。

第一作者简介

陈飘飘，四川大学华西医院实验医学科助理研究员；四川大学“医学+制造”中心办公室主任。主要从事医学检验新技术和方法（结核，肿瘤，微生物，感染等，及便携式/手持式仪器的研发工作。至今已在ACS Nano, Nano Lett, Anal Chem, Biosens Bioelectron等杂志上发表第一/通讯作者SCI论文28篇。受理/授权国家发明专利16项：实用新型3项，外观设计2项，发明专利11项。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.nanolett.1c04818

DOI：10.1021/acsnano.1c02080

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编辑/排版：陈恒屹 汤文霞

审核：王晓辉