JACS丨复旦大学魏大程丨自驱动“分子电化学系统”用于新冠核酸检测

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截止至2022年10月6日20时，据世卫组织统计，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）确诊人数已超过6.1亿人次，其中死亡人数超652万人。新冠核酸检测的金标准是实时荧光逆转录PCR，但其灵敏度较低易导致混检假阳性等问题。因此，亟需快速、超敏的新冠检测方法，以迅速、准确地从大量待检人群中找到感染者，遏制病毒的传播和变异。

电化学生物传感技术，尤其是基于微电极的电化学生物传感技术，因其具有响应速度快、电流密度大、信号明显、操作简单、成本低和可便携化等优点，使之成为一种具有应用潜力的核酸检测方法。然而，由于其传感过程缺乏可控性，导致电化学生物传感在实现核酸的高精准检测面临巨大挑战。

     近日，复旦大学魏大程研究团队在Journal of the American Chemical Society上发表题为“Electrochemical Detection of a Few Copies of Unamplified SARS-CoV‑2 Nucleic Acids by a Self-Actuated Molecular System”的应用研究。该研究提出“分子电化学系统”，可实现痕量新冠病毒检测。研究表明，将“分子电化学系统”修饰在工作电极表面，通过自驱动在分子尺度上调节电化学过程，可将检测限提高2至6个数量级。

通讯作者：Dacheng Wei

第一作者：Daizong Ji

作者构建了修饰在石墨烯微电极上的自驱动分子-电化学系统（molecular-electrochemical system，MECS），MECS由触手和躯干两部分组成（图1）。MECS的躯干是一个规则的四面体结构，触手在躯干的顶端，由一条延伸的柔性单链DNA(ssDNA)组成。该触手可识别并结合SARS-CoV-2核酸，触角尖端用亚甲基蓝标记，作为信号发生器。在石墨烯微电极上施加负电位，由于ssDNA骨架上的负电荷，触手在石墨烯表面的局部电场中自发保持直立。一旦核酸被识别，靶标的空间效应和负电荷产生的静电力会自动驱动触手向下到达电极表面，从而引起电流响应的变化。

图1. 工作原理示意图

    作者首先验证MECS是否成功修饰到石墨烯电极表面(图2)。原子力显微镜(AFM)图像显示，MECS为三维结构且均匀地固定在石墨烯表面(图2d)。MECS躯干的理论高度约为5.3 nm，接近触须的理论长度(6.8 nm)，与设计的结构相似。XPS结果显示， PASE处理后的石墨烯出现氮元素峰，表明MECS的成功修饰。

图2. 验证MECS修饰到石墨烯电极表面

(a)以DNA纳米结构为基础的MECS结构。(b) SARS-CoV-2 IVT RNA传感过程的MECS示意图；F₁代表将触手拉离电极的局部电场的向上排斥力，F₂代表促使触手靠近电极的向下驱动力和空间效应。(c)MECS修饰的石墨烯微电极的器件配置(d)流体中用MECS修饰的石墨烯的原子力显微镜图像。(e)原始的、经PASE处理的石墨烯和MECS/PASE改性的石墨烯的XPS数据。(f)原始石墨烯(红线)和经PASE处理的石墨烯(蓝线)的代表性拉曼光谱。分别在加入SARS-CoV-2 IVT RNA前(g)和加入后(h)，用MECS固定石墨烯的荧光强度图像。

      随后，作者对MECS的检测稳定性进行验证。如图3a，b所示，电流响应随着SARS-CoV-2IVT RNA的浓度的增加出现了不同幅度的波动，表明MECS具有较高的检测灵敏度。在图3c中，SWV和DPV产生的归一化电流信号作归一化处理，结果显示较好的线性相关性。图3d中特异性结果显示，仅在体系内存在SARS-CoV-2核酸（样本4）时，有较高的电化学信号。

图3. MECS超灵敏电化学检测SARS-CoV-2 IVT RNA

 (a)MEC修饰的石墨烯微电极在人工唾液中加入SARS-CoV-2 IVT RNA(从0.05拷贝/μL到500拷贝/μL)时的DPV和SWV响应。(c)DPV(红线)和SWV(蓝线)在不同浓度SARS-CoV-2 IVT RNA的对数标度下的归一化电流，误差条代表标准偏差(n=3)。(d)SARS-CoV-2 RNA特异性检测的统计数据，误差条代表标准偏差(n=3)。样本1(人单链DNA)、样本2(MERS冠状病毒IVT RNA)、样本3(SARS冠状病毒IVT RNA)、样本4(SARS冠状病毒2 IVT RNA)

随后，作者分别对电极尺寸、沉积电压、躯干高度进行优化。结果显示，当电极半径为1mm、沉积电压为0.7V、躯干长度为5.3nm时，具有更宽的检测范围和更高的灵敏度(图4d)。

图4. MECS超灵敏检测SARS-CoV-2RNA的机制

 (a)在生物流体中具有特定生物识别和信号转导的RNA检测的MECS示意图。（b）SWV法对不同半径的电极在不同浓度的SARS-CoV-2 IVT RNA下的归一化电流响应。(c)不同电压沉积(0.7V和−0.7V)和全唾液中未沉积微血管内皮细胞的SWV响应。(d)使用SWV和DPV对经不同MECS躯干高度电极的归一化电流响应。(e)使用DPV和SWV的不同激励幅度下的电流响应。插图：用于检测的不同幅值下的MECS示意图。 

最后，作者对临床标本进行验证。结果显示SARS-CoV-2患者样本的归一化电流强度明显高于健康样本，且与RT-PCR结果一致(图5c)。此外，MECS还用于10合1混合临床样本测试。结果显示，当混合样本中有新冠患者时，可观察到显著的电化学信号。

图5. 临床样本验证

 (a)用RT-PCR和MECS修饰的石墨烯微电极检测SARS-CoV-2临床样本的程序。(b)新冠肺炎患者和健康人稀释的临床样本的当前反应的统计数据；误差条代表标准偏差(n=3)。(c)临床样本(n=42)在双盲试验中的当前反应。(d)用于混合样品测试的差示脉冲伏安图和方波伏安图。(e)用DPV和SWV测试的混合样本的统计数据；误差条代表标准偏差(n=3)。

      传统的RT-PCR方法检测时间较长（2小时），在混检时难以达到理想的灵敏度。作者开发的电化学检测系统在提取核酸后，仅需5分钟即可直接读数，灵敏度达到0.025拷贝/uL，具有广阔应用前景。通过触手探针的重编程，该方法可适用于埃博拉病毒、寨卡病毒和新冠变体病毒等病原体检测。

参考文献

JI D, GUO M, WU Y, et al. Electrochemical Detection of a Few Copies of Unamplified SARS-CoV-2 Nucleic Acids by a Self-Actuated Molecular System [J]. Journal of the American Chemical Society, 2022, 144(30): 13526-13537.

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c02884?ref=pdf

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撰稿/排版：孙金元 付云倩

审核：罗阳 张洪