农业部 第2485号中公布的动物肝脏和脂肪中大观霉素和林可霉素残留检测 液相色谱-串联质谱法（试行）
大观霉素和林可霉素残留检测方法（试行）
动物肝脏和脂肪中大观霉素和林可霉素残留检测
液相色谱-串联质谱法（试行）
000011 范围
本标准规定了动物肝脏和脂肪中大观霉素和林可霉素残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于猪和鸡的肝脏、脂肪中大观霉素和林可霉素残留量的测定。
000012 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 1.1-2000 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
000013 原理
试料中的残留药物经磷酸二氢钾缓冲液提取后，调其pH值，经羧酸型固相萃取柱净化，浓缩后残余物用七氟丁酸溶液溶解，供液相色谱-串联质谱法测定。用基质匹配标准溶液，外标法定量。
000014 试剂和材料
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。
4.1 大观霉素对照品，来源中国食品药品检定研究院
4.2 林可霉素对照品，来源中国食品药品检定研究院
4.3 甲醇 色谱纯
4.4 乙腈 色谱纯
4.5 磷酸二氢钾
4.6 三氯乙酸
4.7 二水合乙二胺四乙酸二钠
4.8 正己烷
4.9 乙酸
4.10 七氟丁酸（HFBA），纯度≥99.5%
4.11 10mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液（含0.4mmol/L 乙二胺四乙酸和2%三氯乙酸） 称取2.72g 磷酸二氢钾，溶解于2.0L水中，用1mol/L盐酸溶液调pH至4.0；再加入0.3g 二水合乙二胺四乙酸二钠和40g三氯乙酸，混匀即得。
4.12 10%乙酸甲醇溶液 量取5mL乙酸，溶于45mL甲醇中，混匀即得。
4.13 30%氢氧化钠溶液 称取30g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100mL，混匀即得。
4.14 1mol/L盐酸溶液 取8.6mL盐酸，加水稀释至100mL，混匀即得。
4.15 20mmol/L HFBA溶液 取0.26mL HFBA，加水稀释至100mL，混匀即得。
4.16 标准储备液（1mg/mL） 准确称取适量的大观霉素和林可霉素对照品，用甲醇分别配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，2～8℃保存，有效期1个月。
4.17 标准工作液（10μg/mL和1μg/mL） 准确吸取0.1mL的大观霉素和林可霉素标准储备液分别置10mL容量瓶中，用20mmol/L HFBA溶液稀释至刻度，摇匀即得浓度为10μg/mL标准溶液。大观霉素配制完后转移至塑料试管内于4℃冰箱保存，有效期为1周。从中取1.0mL至10mL容量瓶中，用20mmol/L HFBA溶液稀释至刻度，摇匀即得浓度为1μg/mL的标准溶液。大观霉素配制完后转移至塑料试管内于4℃冰箱保存，有效期为1周。
4.18 基质匹配标准溶液：向空白组织经提取、净化、浓缩后的基质中，分别准确加入适当浓度的大观霉素和林可霉素标准工作液，充分涡旋混匀，即得。
000015 仪器和设备
5.1 液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）
5.2 分析天平 感量0.0001g
5.3 天平 感量0.01g
5.4 涡旋混合器
5.5 高速离心机
5.6 pH计或pH试纸
5.7 固相萃取装置
5.8 羧酸型固相萃取柱 500mg/3mL，或相当者。
5.9 氮吹仪
5.10 微孔滤膜 0.22μm。
000016 试料的制备与保存
试料的制备包括：
——取匀质的供试样品，作为供试试料。
——取匀质的空白样品，作为空白试料。
——取匀质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
000017 测定步骤
7.1 提取
称取2（±0.02）g试料，加10mmol/L 磷酸二氢钾缓冲溶液（含0.4mmol/L EDTA和 2％三氯乙酸）10.0mL，涡旋混合后，中速振荡提取5min，10000r/min离心10min，取上清液于另一50mL离心管内，加5.0ml正己烷，中速振荡5min后，8000r/min离心8min；离心后取一半下清液（5.0mL），用30%氢氧化钠溶液调其pH值至7.5～8.0，10000r/min离心10min，上清液作为备用液。
7.2 净化
羧酸型固相萃取柱依次用甲醇、水各5.0mL活化，取全部备用液过柱，控制流速为1~3mL/min，用水5.0mL以同样速度淋洗柱子，充分抽干，用10%乙酸甲醇溶液3.0mL洗脱于塑料试管内；洗脱液于50℃下氮气吹干。
残余物加入20mmol/L HFBA溶液1.0mL，充分涡旋溶解，取适量溶液过滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。
7.3 基质匹配标准曲线的制备
分别准确量取大观霉素和林可霉素标准工作液适量，对于猪肝和鸡肝，制得大观霉素浓度为250、500、1000、2000和4000ng/mL、林可霉素浓度为25、50、100、250和1000ng/mL的系列基质匹配标准溶液；对于猪脂肪和鸡脂肪，制得大观霉素浓度为250、500、1000、2000和4000ng/mL、林可霉素浓度为10、20、50、100和200ng/mL的系列基质匹配标准溶液。过滤膜后上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
7.4 测定
7.4.1 液相色谱参考条件
色谱柱：C18（50×2.1mm，1.7µm），或相当者；
流动相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液；
梯度洗脱：0～1min，保持5％A；1～5min，5%A线性变化至50％A；5～6min，保持90%A；6～7min，维持5％A。
流速：0.3mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10µL。
7.4.2 质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电离电压：3.2kV；
源温：110℃；
雾化温度：350℃；
锥孔气流速：50L/h；
雾化气流速：650L/h；
待测药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量见表1。
表1 大观霉素和林可霉素定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量
药物 | 定性离子对 (m/z) | 定量离子对 (m/z) | 锥孔 电压(V) | 碰撞 能量(eV) |
大观霉素 | 351.4﹥97.7 | 351.4﹥97.7 | 40 | 30 |
351.4﹥139.8 | 25 | |||
林可霉素 | 407.4﹥125.9 | 407.4﹥125.9
| 40
| 30 |
407.4﹥359.3 | 20 |
7.4.3 测定法
取试料溶液和基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，外标法计算。试料溶液及基质匹配标准溶液中大观霉素和林可霉素的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。空白组织试样溶液、基质匹配标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图分别见附录A中图A.1~图A.3。
表2 试料溶液中离子相对丰度的允许偏差范围
相对丰度（%） | 允许偏差（%） |
＞50 | ±20 |
20～50 | ±25 |
10～20 | ±30 |
≤10 | ±50 |
7.4.4 空白试验
取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
000018 结果计算和表述
单点校准：
或基质匹配标准曲线校准：由As＝aCs＋b，
求得a和b，则
按下式计算待测药物的残留量：
式中：
X——供试试料中待测药物的残留量（µg/kg）；
Cs——基质匹配溶液中相应待测药物浓度（ng/mL）；
C——供试试料溶液中相应待测药物浓度（ng/mL）；
As——基质匹配溶液中相应待测药物峰面积；
A——供试试料溶液中相应待测药物峰面积；
V——残余物定容体积（mL）；
——供试试料质量（g）。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
000019 检测方法灵敏度、准确度和精密度
9.1 灵敏度
大观霉素在猪、鸡的肝脏、脂肪中的定量限为500µg/kg，林可霉素在猪、鸡的肝脏中的定量限为50µg/kg，在猪、鸡的脂肪中的定量限为25µg/kg。
9.2 准确度
本方法大观霉素对猪、鸡的肝脏、脂肪组织在500µg/kg～4000µg/kg添加浓度范围内，林可霉素对猪、鸡的肝脏组织在50µg/kg～1000µg/kg添加浓度范围，林可霉素对猪、鸡的脂肪组织在10µg/kg～200µg/kg添加浓度范围内回收率均为60%～120%。
9.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
（资料性附录）
大观霉素和林可霉素特征离子质量色谱图
图A.1 空白鸡肝试样溶液特征离子质量色谱图
图A.2 空白鸡肝基质匹配标液（500ng/mL大观霉素和50ng/mL林可霉素）特征离子质量色谱图
图A.3 500ng/g大观霉素和50ng/g林可霉素空白鸡肝添加试样溶液特征离子质量色谱图
图A.4 空白鸡脂肪试样溶液特征离子质量色谱图
图A.5 空白鸡脂肪基质匹配标液（1000ng/mL大观霉素和50ng/mL林可霉素）特征离子质量色谱图
图A.6 1000ng/g大观霉素和50ng/g林可霉素空白鸡脂肪加标溶液特征离子质量色谱图
图A.7 空白猪肝脏试样溶液特征离子质量色谱图
图A.8 空白猪肝基质匹配标液（500ng/mL大观霉素和50ng/mL林可霉素）特征离子质量色谱图
图A.9 500ng/g大观霉素和50ng/g林可霉素空白猪肝添加试样溶液特征离子质量色谱图
图A.10 空白猪脂肪试样溶液特征离子质量色谱图
图A.11空白猪脂肪基质匹配标液（1000ng/mL大观霉素和50ng/mL林可霉素）特征离子质量色谱图
图A.12 1000ng/g大观霉素和50ng/g林可霉素空白猪脂肪加标溶液特征离子质量色谱图
注：大观霉素特征离子质量色谱图（351.4>97.7；351.4>139.8）；
林可霉素特征离子质量色谱图（407.4>125.9；407.4>359.3）。
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