农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知
为贯彻落实《遏制细菌耐药性国家行动计划（2016-2020年）》，进一步加强动物源细菌耐药性监测工作，保证动物源性食品安全和公共卫生安全，我部制定了《2017年动物源细菌耐药性监测计划》（附件1，以下简称《监测计划》），现印发给你们，请遵照执行。有关事项通知如下。
一、任务分工
农业部负责组织全国动物源细菌耐药性监测工作。
各省（自治区、直辖市）兽医行政管理部门负责选定连续定点监测养殖场（猪场、肉鸡场、蛋鸡场或奶牛场各1个，共3个），保证监测工作的连续性，并协助监测任务承担单位做好屠宰场和养殖场采样工作。在完成国家监测计划的同时，有条件的省份，应制定并组织实施辖区动物源细菌耐药性监测计划。
中国兽医药品监察所、中国动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心和辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心、上海市兽药饲料检测所、河南省兽药饲料监察所、四川省兽药监察所、广东省兽药饲料质量检验所、湖南省兽药饲料监察所、陕西省兽药监测所等10家监测机构承担《监测计划》的检测任务。
中国兽医药品监察所负责全国动物源细菌耐药性监测的技术指导和数据库建设与维护工作；负责罕见表型菌株的确认、收集和保存；负责各地耐药性监测实验室分离的人畜共患菌（沙门氏菌和弯曲杆菌）的菌种保存，并指导任务承担单位进行沙门氏菌血清分型。
二、技术要求
（一）各监测任务承担单位应按照《2017年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点》（附件2）开展采样、细菌分离和鉴定、耐药性监测和结果上报等工作。
（二）样品应从养殖场（包括鸡场、猪场、奶牛场）或屠宰场抽取。其中，规模养殖场和小型养殖场应各占50%。
（三）采样的同时，应做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》（附件3）。对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分开填写采样表。
（四）大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》（附件4）或参照相关国际标准执行。
（五）中国兽医药品监察所负责药敏试验板的质量控制，各监测任务承担单位进行药敏试验时应按照药敏板使用说明书进行检测。药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法见附件5。
三、结果报送
（一）监测结果电子版和纸质材料并行上报。其中，电子版直接登录中国兽药信息网（www.ivdc.org.cn），在中国兽药数据库下选择“耐药性监测”数据库，输入本单位用户名和密码，打开后直接输入监测结果。纸质采样记录和药物敏感性试验统计表（附件6）应按统一格式填报。
（二）各监测任务承担单位的电子版总结于2017年11月25日前上报中国兽医药品监察所。2017年12月31日前，由中国兽医药品监察所完成汇总报我部兽医局。
联 系 人：农业部兽医局冯华兵
中国兽医药品监察所徐士新
联系电话：010-59192829，59191652（传真）
010-62103658，62103698（传真）
附件：1.2017年动物源细菌耐药性监测计划
2.2017年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点
3.采样记录表
4.动物源细菌分离和鉴定方法
5.药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法
6.耐药性监测结果统计表
农业部
2017年2月9日
附件1：
附件2：
附件2
2017年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点
一、采样安排
（一）采样地点
各相关省级兽医行政管理部门应在各自辖区范围内选定符合数量要求的定点养殖场并报农业部兽医局备案，且须保证采样的稳定性和连续性。
各监测任务承担单位按照《监测计划》以及采样地省级兽医行政管理部门提供的定点养殖场进行采样和分离细菌；负责对该省设立的全国定点监测场长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药性变化趋势，每年采样2次，分上半年和下半年进行。
（二）采样类型
采集泄殖腔或盲肠拭子作大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯曲杆菌分离；采集新鲜牛奶作金黄色葡萄球菌分离，根据养殖场规模，每个场采样50-100份。
（三）监测的细菌种类
包括大肠杆菌、肠球菌（分为屎肠球菌和粪肠球菌）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌（分为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌）等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地分离情况进行监测。
二、兽药使用调查
各监测任务承担单位要认真做好饲料和饲料药物添加剂来源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查（预防用药和治疗用药）和采集样品的统计，据实填写采样记录表。
三、细菌分离与鉴定
采用选择性培养基，定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌分离，用生化试验、PCR技术或血清学方法对分离物进行鉴定。本年度分离监测的细菌种类与数量要求见《监测计划》。分离到的菌株在-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或用其它合适方法自行保存，沙门氏菌和弯曲杆菌送中国兽医药品监察所进行血清型鉴定后保存。
四、药物敏感性测定
采用经中国兽医药品监察所质量认定的药敏试验板进行药物敏感性检测。目前，已实施质量认定的药敏板生产企业有：天津市金章科技发展有限公司和上海星百生物技术有限公司。
检测用质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。
五、结果报送
由中国兽医药品监察所将本年度总结任务分配到各监测任务承担单位。各单位需在11月25日之前完成，并将电子版总结报送中国兽医药品监察所。由中国兽医药品监察所汇总，在12月31日前报送农业部兽医局。
附件3：
附件4：
附件4
动物源细菌分离和鉴定方法
一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定
000011 范围
本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法。
本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。
2.1 冰箱：2-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：36±1℃。
2.3 电子天平：感量0.1g。
2.4 显微镜：10×～100×。
2.5 生物安全柜。
2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条。
2.7 采样管或商品化采样棉拭子。
2.8 微量加样器：1μL～1000μL。
2.9 吸头（与微量加样器匹配）。
3 培养基和试剂
3.1 运送培养基。
3.2 麦康凯琼脂。
3.3 大肠杆菌阳性血清。
4 大肠杆菌分离与鉴定程序
大肠杆菌分离与鉴定程序见图1。
5.操作步骤
5.1 采样
选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。
5.2 大肠杆菌的分离
5.2.1 拭子接种于麦康凯琼脂平板，36±1℃培养18-24h；
5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，麦康凯琼脂纯化一代，
5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36±1℃培养16-18h，待进一步细菌鉴定。
5.3 大肠杆菌的鉴定
对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定。
必要时，采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。
二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定
1范围
本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法。
本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。
2.1 冰箱：2℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。
2.3 电子天平：感量0.1g。
2.4 显微镜：10×～100×。
2.5 生物安全柜。
2.6 恒温水浴锅：37℃～100℃。
2.7 PCR仪。
2.8 电泳仪。
2.9 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。
2.10 冷冻离心机。
2.11 采样管或商品化采样拭子。
2.12 小型离心管。
2.13 微量加样器：1μL～1000μL。
2.14 吸头（与微量加样器匹配）。
2.15 漩涡仪。
2.16 微波炉。
3 培养基和试剂
3.1 标准菌株：沙门氏菌CVCC 541
3.2 DNA Maker
3.3 Taq DNA 聚合酶
3.4 dNTP
3.5 琼脂糖
3.6 5×TBE缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 54.0g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA（pH8.0） 20mL
加纯净水至 1000mL
3.7 50×TAE buffer
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242g
NA2EDTA.2H2O 37.2g
醋酸 57.1ml
加纯净水至 1000mL
3.8 invA基因引物
上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′
下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′
3.9 运送培养基。
3.11 沙门氏菌显色琼脂。
3.12 沙门氏菌阳性血清。
3.13 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）。
3.14 四硫磺酸盐增菌液（TTB）。
3.15 核酸染料。
3.16 氯化钠。
4 沙门氏菌分离与鉴定程序
沙门氏菌分离与鉴定程序见图2。
5.操作步骤
5.1 采样
选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔（肛门）样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。
5.2 沙门氏菌的分离
5.2.1 将拭子置于SC增菌液，36±1℃培养18-24h 或TTB增菌液，42±1℃培养22-24h。
5.2.2 将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，36±1℃培养22-24h。
5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，36±1℃培养16-24h，待进一步细菌鉴定。
5.3 沙门氏菌的鉴定
5.3.1 生化鉴定
对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，或者通过5.3.2的方法进行分子生物学（PCR）鉴定。
必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。
5.3.2 PCR法鉴定
5.3.2.1 PCR模板的制备
用接种环从营养琼脂上挑选16-24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。
5.3.2.2 PCR反应体系的配制
根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度约284 bp。
5.3.2.3 PCR反应条件
95℃预变性5min，94ºC变性30s, 64ºC退火30s，72ºC延伸30s, 30个循环，最后72ºC延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。
5.3.2.4 电泳
5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备
称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液淹没胶面。
5.3.2.4.2 加样
取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。
5.3.2.4.3 电泳条件
电压110V，电泳时间30min。
5.3.2.5 结果判定
电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。
如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。
三、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定
1 范围
本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。
本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：36℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×～100×。
2.4 商品化或自制采样管。
2.5 无菌离心管
2.6 离心机。
2.8 商品化拭条或微生物鉴定仪。
3 培养基和试剂
3.1 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213
3.2 显色培养基
3.3 7.5 %氯化钠肉汤10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤
3.4 营养肉汤或BHI肉汤
3.5 营养琼脂
3.6 新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆
3.7 0.3%过氧化氢液
3.8 0.85%无菌生理盐水
4 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序
金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。
5 操作步骤
5.1 采样
5.1.1牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0-4℃保存，不超过48h。
5.1.2扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0-4℃保存不超过48h。
5.1.3 吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。
5.2 增菌和分离培养
5.2.1 将上述样品匀液于36±1 ℃培养18-24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 36±1 ℃培养24-48h。
5.2.3 挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。
5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定
5.3.1生化鉴定 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。
将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5mL灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作， 37℃培养18-24h后判读结果。
5.3.2血浆凝固酶试验法 挑取显色平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板，36±1℃培养18-24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。
新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL,溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 (或以3000r/min 离心30 min)，使血液细胞下降，即可得血浆。
取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2-0.3 mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定
1 范围
本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。
本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。
2.1 采样管
2.2 采样棉拭子
2.3 生物安全柜
2.4 恒温培养箱: 25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃。
2.5 恒温水浴锅：37℃～100℃。
2.6 微需氧条件：5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气，或商品化微需氧包。
2.7 显微镜：10×～100×。
2.8 微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条
2.9 高速冷冻离心机：≥12000r/min。
2.10 小型离心管：1.5mL。
2.11 微量加样器：1μL～1000μL。
2.12 吸头（与微量加样器相匹配）
2.13 PCR仪
2.14 微波炉
2.15 电泳仪
2.16 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）
3、培养基和试剂
3.1 质控菌株：空肠弯曲杆菌标准菌株（ATCC 33560）
3.2 DNA Marker
3.3 引物及扩增片段长度
3.3.1 引物
空肠弯曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’，下游 5’AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’，扩增片段长度为 773bp。
结肠弯曲杆菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，扩增片段长度为364bp。
3.4 运送培养基
3.5 弯曲菌选择性（CCD）培养基
3.6 哥伦比亚血琼脂培养基
3.7 生理盐水
3.8 10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ
3.9 氯化镁溶液（25mM）
3.10 Taq 聚合酶（0.5U/μL）
3.11 dNTPs（2mM）
3.12 琼脂糖
3.13 50×TAE缓冲液：将242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5M EDTA（pH8.0），加纯水至1000mL。
1×TAE缓冲液： 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。
3.14 上样缓冲液
3.15 溴化乙锭溶液（10mg/mL）：称取1g溴化乙锭溶于100mL水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。
3.16 矿物油
4 空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序
空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。
5 操作步骤
5.1 分离与纯化
5.1.1 分离
将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。
5.1.2 培养
将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h-48h。
5.1.3 纯化
观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。
5.2鉴定
5.2.1生化鉴定
对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，并进行结果判定。或者通过5.1-5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。
5.2.2 分子生物学（PCR）鉴定
用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5mL生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷却5min后，12000r/min(4℃)离心2min，取上清作为PCR模板。
5.2.2.1 PCR反应体系
根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。
5.2.2.2 PCR反应条件
采用的PCR反应条件见下表。
5.2.2.3 电泳
5.2.2.3.1 1.0%琼脂糖凝胶板的制备
称取1.0g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）中。加热融化后加5μL（10mg/mL）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）淹没胶面。
5.2.2.3.2 加样
取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物各1孔作为对照。
5.2.2.3.3 电泳条件
电压110V，电泳时间40min。
5.2.2.4 结果判定
电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。
如果某一待检样品扩增产物的条带与空肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为空肠弯曲杆菌；如果与结肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为结肠弯曲杆菌；
必要时，可以通过测序来进一步确证。
五、 动物源屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定
1 范围
本方法规定了用于屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定的方法。
本方法适用于各种动物中屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。
2.1 冰箱：2-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：36±1℃。
2.3 电子天平：感量0.1g。
2.4 显微镜：10×～100×。
2.5 生物安全柜。
2.6 生化鉴定卡或商品化试条。
2.7 采样管或商品化采样棉拭子。
2.8 微量加样器：1μL-1000μL。
2.9 吸头（与微量加样器匹配）。
3 培养基和试剂
3.1 运送培养基。
3.2 肠球菌显色培养基。
4 屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序
屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序见图5。
5.操作步骤
5.1 采样
选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。
5.2 屎肠球菌和粪肠球菌的分离
5.2.1 拭子接种于肠球菌显色琼脂平板，36±1℃培养18-24h；
5.2.2 挑取红色至紫红色的可疑菌落，显色琼脂上纯化一代，
5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36±1℃培养16-18h，待进一步细菌鉴定。
5.3 屎肠球菌和粪肠球菌的鉴定
对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定、判定结果。
必要时，采用肠球菌标准血清进行血清型鉴定。
附件5：
药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法
1. 范围
本方法规定了动物源细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌）药敏检测试剂盒的使用方法。
2. 材料
除微生物实验室常规灭菌设备外，其他设备和材料如下：
2.1 恒温培养箱35±2℃
2.2 生物安全柜
2.3 浊度计或者标准比浊管
2.3 微量加样器1uL-1000uL
2.4 吸头（与微量加样器匹配）
3. 操作步骤
3.1 取出试剂盒，打开包装待用。
3.2 菌液制备
将无菌棉签用生理盐水润湿后，直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落，与适量无菌生理盐水混匀。然后，用标准比浊管或者浊度计校正菌液浓度至0.5麦氏单位（1-2×108CFU/mL）。最后，用试剂盒中的肉汤100倍稀释，混匀备用。
3.3 菌液接种
除空白对照外，其余的95孔加入制备好（用前要混匀）的菌液100µL
空白对照孔中加入100µL无菌肉汤。盖好板盖并记录菌号。
3.4 孵育
将检测板置于35℃±2℃很稳培养箱中孵育16-18小时。
3.5 观察结果
在衬有黑底板的光线下，用肉眼观察。
先观察阴性对照孔和阳性对照孔：阴性对照孔应无细菌生长，孔内液体未见浑浊；阳性对照孔内应有细菌生长所形成的圆形或者网状沉淀。
如果阴性和阳性对照结果正常，继续观察其余孔内细菌生长情况，在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。
4. 结果记录
将MIC结果记录在耐药性检测结果统计表（附件6）中。
附件6：
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