曝光假疫苗，人头被悬赏500万，冒死将160名黑恶分子送进监狱，揭露真相的他们，如今身在何处？
本文由锐视界（rshijie）原创
作者：瞎子阿杰
疫苗案轰动全国，震惊高层领导。随着一系列疫苗事件的曝光，几个制药公司的大佬也被民众给揪了出来。
此次长生生物的疫苗事件让人联想到八年前山西的那场疫苗事故。山西疫苗案共造成了山西百余名儿童的伤残或死亡，其影响之恶劣比起长生疫苗案有过之而无不及。
在山西疫苗事件中，有两个媒体人，因为公开公正报道该事件，被所属部门《中国经济时报》给解职。
为了报道真相，为了给受害人一个公平的答复，他们提着脑袋走上前线，最后丢了饭碗，离开了新闻行业。
他们曾给了无数民众以公正和慰藉，他们的结局也令无数媒体人心酸。
还是那句话：英雄可以战死，但不可被世人遗忘。
他们俩，一个是《中国经济时报》前首席记者王克勤，另一个，则是他当时的顶头上司——《中国经济时报》前总编辑包月阳。
左：王克勤；右：包月阳
01
王克勤出生于1964年，甘肃省永登县人。
他肤色黝黑，相貌平平，还有点谢顶。生活中，他也不总是那么严肃。挺着个微微发福的肚腩，着装打扮也十分随意，扔到人堆里，谁都不会看他一眼。
王克勤老师
然而就是这样一个人，曾被评为2002年度中国传媒杰出人物、2003年中国十大维权人物、2003年度中国记者八大风云人物、2004年中国十佳曝光勇士等等。
他是中国当代最有名的揭黑记者，被业界誉为“中国的林肯·斯蒂芬斯（美国著名揭黑记者）”。黑社会曾扬言要出价500万买他的人头，也让他有了“中国身价最高的记者”的美名。
他的职业生涯里，曾先后推出过多篇震惊国人的报道。
他采写的《兰州证券黑市狂洗“股民”》，揭开了兰州证券黑市的真面目。此文一出，立刻引发了有关部门在全国范围内展开一场声势浩大的铲除证券黑市的专项行动，还为兰州近万名受害者挽回了数亿元的损失；
他的《公选“劣迹人”引爆黑幕》发表后，引起甘肃省委省政府的极大重视。6个部门、近50人的专案组，进驻报道中提到的堡子乡进行调查，10名“恶霸乡干部”受到法律制裁；
为了调查定州征地案，他把自己打扮成农民，把相机和笔记本藏在麻袋里，开着拖拉机突破封锁线。《河北定州血案》一经刊登，6名在征地过程中被黑社会打死的农民得到了正义的伸张，原定州市委书记和风被送上了审判台。
仅仅是在2001年，这个貌不惊人的中年男子就用他的笔和良心，把160多个黑恶分子给送进了监狱。
由于揭黑太出名，他曾收到一条传呼，上面写着：我们知道你的家庭住址，今晚过去“接”你老婆孩子。
为此，警方甚至特意派出4名荷枪实弹的警察去他家里保护他。
这些风险和困难从没有让王克勤退缩过。惩恶扬善，为民众争不平、谋幸福，一直是他的人生信条。
为什么一个记者要一直跟黑恶势力对着干？王克勤面对同行的采访，讲出了这样一个故事。
2003年非典期间，他在经济时报的总部办公，突然有门卫喊他，说有个出租车司机想要见他。
他在公司大门口见到了这名来自乌鲁木齐的出租车司机。对方手里提着一袋莫合烟丝，对王克勤说：
“王老师，我代表全新疆三万多出租车司机来看你。我们乌鲁木齐人民爱抽莫合烟，他们说抽莫合烟不会得非典。我们送你莫合烟抽，这样你就能健健康康了。感谢你，王老师。”
这名出租车司机把莫合烟送到王克勤手里，寒暄了几句后就走了。
从乌鲁木齐到北京，他得坐三天两夜的火车，然后再这样坐回去。当时北京疫情严重，这名司机回到乌鲁木齐被隔离了20多天。他这么做，图什么？
因为王克勤写过一篇名为《北京出租车业垄断黑幕》的报道，推动了出租车行业的良性改革。这一事件，让远在西北的新疆司机，深受感动。
这份出租车司机带来的安慰让王克勤从中体会到了媒体人的价值与意义，他曾发誓要将自己的一生都献给新闻调查事业。
然而这一切，都因为山西疫苗事件而终结。
从能查阅到的资料可以获悉，山西的疫苗最初从2006年就开始“出问题”。
2006年，山西男孩强强接种了乙脑疫苗后，出现了发烧症状，医生诊断为“乙脑（乙型脑炎）”。在几次病危通知后，强强的命保住了，但却留下了终生后遗症，会不定时抽风。强强的父母怎么也想不明白，为什么健健康康的孩子，接种了“乙脑疫苗”后，还能患上“乙脑”。
2006年，山西女孩慧慧接种了麻疹风疹联合疫苗，十几天后发病，被诊断为“过敏性紫癜”。
2007年，7个月大的紫阳接种乙肝疫苗后，被诊断为“过敏性紫癜”。
2008年，3岁的妞妞接种了乙脑疫苗，一个月后突发病症，疑似紫癜、脑炎……
这样的孩子，一共有百余名。
这一事件一直拖到2010年。时任《中国经济时报》首席记者的王克勤，亲赴山西调查半年，写出了两万字的重磅报道——《近百孩子不明病因致死致残——山西疫苗乱象调查》。
3月17号，时任《中国经济时报》总编的包月阳，签发了这篇报道。
在签发这篇报道之前，包月阳对王克勤说了一句话：“我已经做好牺牲一切的准备。”
02
如果论起面相来，王克勤看上去比较油腻接地气，而包月阳则是一副和蔼可亲的老者形象。
他一头白发，温和儒雅，很喜欢佛道和禅意。在单位里，大家都亲切地称他“老包”。
包月阳老师
包月阳出生于1963年，老家是河南省舞阳县。1979年，他考入了武汉大学经济系。毕业后，有幸被分配到了新华社工作。
1994年，包月阳荣获新华社首届十佳记者的称号。随后，在国务院研究中心的倡议下，他参与筹办了如今的《中国经济时报》，任常务副总编。《中国经济时报》的试刊、创刊和采编业务都是他主持的，他对时报风格的形成起到了关键作用。
“对读者负责，对历史负责”，这句话，一直是包月阳所坚持的办报理念。三年后，他升任《中国经济时报》总主编，在这个位子上，他一干就是13年。
包月阳老师
进入21世纪之后，在包月阳的带领下，《中国经济时报》加强了调查性报道。调查兰州证券黑市事件，便是王克勤与包月阳的第一次“触电”。那时候，王克勤只是《甘肃经济日报》的一名普通记者。
两个月后，因证券黑市的曝光，《甘肃经济日报》暂时停办。王克勤辗转多次，最终来到了《中国经济时报》安家落户。
在包月阳的支持下，各类打黑揭黑的深度调查、在经济时报上如雨后春笋一般地出现。为此，包月阳没少挨上级领导的批评，也没少做过检查。
“只要是好报道，多写一些检查，对我而言也是一种提高啊。”他笑着跟王克勤说。
2010年签发《山西疫苗乱象调查》时，包月阳意识到了这件事情的严重后果。当时报社总部就有人劝他：“别签这篇，签了肯定出事儿！”
包月阳只说了一句话：“不签，对不起孩子。”
该期报纸刊发后，果然掀起了社会舆论的惊涛骇浪，同时，他们也遭到了山西方面的“凶猛反扑”，对方声称他们的“报道不实”。
对此，包月阳毫不畏惧，随即在网上发了一篇《中国经济时报关于“山西疫苗乱象调查”报道的声明》，立场鲜明地与黑恶势力展开对决。
不仅如此，他还不断地给自己的属下打气：
为了更多中国孩子的安全，我们战斗到底！哪怕牺牲一切，也在所不惜！
两个月后，他被免去了《中国经济时报》总主编的职务。
随后，王克勤也被《中国经济时报》给解雇，经济时报的调查部被就地解散。
03
包月阳被解职后，王克勤找到他，满怀歉意地对他说：“老包，对不住啊，因为我的报道害你丢了饭碗。”
老包说：“求仁得仁，是你成就了我。”
话毕，俩人对视，开怀大笑。当晚，他俩在一块喝了个烂醉，最后双双被送到医院去挂水。
或许只有喝醉的那一刻，这两个媒体人才有片刻的解脱。那颗为了人民大众谋利益的良心，才不会那么痛。
王克勤离开时，在自己的办公室整理了足足两吨重的上访材料。这些材料是全国各地的民众或是寄给他、或是亲自来北京送给他的。临走时，王克勤带走了这些材料。
他在微博上写道：对别人而言，这些材料相当于废纸；对我而言，这些都是民众给我的信任。虽然堆着的全是苦难和血泪，但我一直视其为宝贝，走到哪里带到哪里。家具可以扔，信任不能丢！
王克勤离开了新闻行业，投身于“大爱清尘”公益活动。这是他于2011年发起的救助中国600万尘肺病人的一个专项活动，后来在崔永元的介绍下，袁立也成为了该公益活动的重要推动者。
包月阳离职时，在微博上写了一段话：
“生活里的忧愁来源于我们的得与失、患得患失。也来源于我们对自己未来命运感觉到不可把握，难以预料。所以，算命术长盛不衰。而一颗禅心是彻底放下了忧愁的。”
包月阳放下了吗？
长生生物的毒疫苗被曝光后，包月阳的微博在7月22日更新了这样一条消息：
有时候，时间能改变一切。有时候，时间什么也改变不了。
他们把理想和生命都献给了公众，如今却只能“望疫兴叹”。到底是他们辜负了我们，还是我们辜负了他们？
04
前天，我们的主席和总理先后公开作出重要批示，他们措辞强硬地指出：
对疫苗事件的真相要一查到底，严肃问责。一定要给全国人民一个明明白白的交代。
昨天，王克勤老师开通了公众号，并发表了第一篇公众号文章《要不要打疫苗——山西疫苗事件记者王克勤给妈妈们的一封信》。
王克勤老师提出了两个观点：一是疫苗一定要打，二是国产疫苗的管控亟待提高。
也就在昨天，此次疫苗事件的始作俑者、长生生物的董事长高某芳等15名涉案人员，被警方依法采取刑事拘留强制措施。
那个明明白白的交代，相信很快就会到来。人们对社会的发展和变革，又有了新的希望。
鲁迅说：“我想：希望本是无所谓有，无所谓无的。这正如地上的路。其实地上本没有路，走的人多了，也便成了路。”
而那些为我们拓路的人，如今还有多少人记得呢？
为众人抱薪者，不可使其扼于风雪；
为自由开路者，不可使其困于荆棘。
风波过后，我们会忘记他们吗？
想必每个人的心中，都会有一个共同的答案。包月阳和王克勤的名字，必将永存于每一个中国人的心底。
正如我们对正义与希望的渴求，永远不会被磨灭一样。
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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega