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重病之下,“钱不能动,房不能卖,救命却来找社会!”

木舒 时局报 今天

文:辣笔小尖椒(lbxjj818)


现在的有些众筹啊,救了一个人,杀了10个人,凉了10000个人的心。


 01 


2016年时,曾有一篇文章刷爆了朋友圈。


作家爸爸罗尔在公号里写出了一篇让无数人泪目的《罗一笑,你给我站住》。求大家捐款众筹,救救他那个身患白血病的女儿!


五天时间,文章被疯狂转发,微信打赏捐款突破100万,加上其他各途径的募捐,捐款总额超过了200万。众人都在心疼这个救不起孩子的家庭,尽自己所能的帮助他们。


可事件的发出出乎所有人的意料。


医疗费医保报销80%,在深圳和东莞有三套房,家里有两辆车,名下还有一家广告公司......


所以事情很明了:罗一笑,爸爸想救你是真的,可不想用自己的钱救你。


奈何事情暴露,网友们像是被敲了一闷棍,善良被欺骗,骂声指责涌向了这家人,而最后罗一笑终究还是没能救回来,永远的离开。


随着罗一笑的离开,这件事慢慢的平息。可自那之后,众筹平台就变味了。


存款不能动,房子不能卖,救命找众筹。这成了众筹平台的常见现象。


“罗尔”们越来越多,大众的同情心渐渐被消费殆尽,而那些真正需要帮助的人,却被断了生存之路。


 02 


前段时间,南宁的邓女士在水滴筹上发起了筹款。


自己20岁的女儿由于病毒感染进了ICU,几次下了病危通知,医院说前妻治疗费用保守估计30万,可自己却无钱为她治病。


“我和她爸爸为看病钱急得夜夜失眠,医药费没有着落”


而最终,网友为她女儿募捐了25万元。


女孩痊愈出院,可事后有网友爆料:邓女士家里并不缺钱,在武鸣有3家粉店,家中有奥迪车,名下有多套房产。



而被曝光后更让人心寒的是那个用网友钱治病的女孩。


她在QQ空间里大骂曝光她家境的人。


“我家开什么车管你什么XX事?你他妈是嫉妒?”

“老子家住的房就算几百万关你什么事?我妈能挣钱关你什么事?”

“可以理解你的羡慕嫉妒恨,能炫的我尽量不让你失望”

“你给了多少钱我还你,不缺你这个傻逼的钱!”



看完这番言论,网络上一片哗然。


捐钱给你治病,却被骂傻逼。


而这件事的结果就是,这个女孩在朋友圈道歉,说要把善款退回去,水滴筹工作人员正在跟进中。


可是能捐钱的人,谁又会在乎那些捐出去的钱?钱能退回来,那被践踏的善心呢?能还的回来吗?


 03 


前几天大家一定被一位37岁胃癌爸爸的遗愿清单刷屏了



没日没夜拼命工作的刘凌峰,应酬多,压力大,抽烟喝酒熬夜。因为这些,37岁的他患上了胃癌。


图片来源:楚天都市报


这篇文章火了,他也火了。后来,他的妻子为了给他治病,在轻松筹上为丈夫发起了30万的筹款,她在信息中写道“真的急需用钱”!而幸运的是几天就筹款完成。



可是让人尴尬的事情又发生了。


很快有人爆出,刘凌峰是地产广告策划人,他的名下有一家房产中介公司,去年出手武汉十多套房产变现。妻子开的是宝马Z4跑车,名下也有一家公司......人家根本不缺钱!


但是真实情况如何,现在还没有个定论,他也发了朋友圈,说接受房查。我想等他病情稳定,会给大众一个交代



可是即使是这样,网友们也不买账了,以他的履历,即使没有网传得那么富有,也不会是救命钱拿不出,大家再一次觉得自己的眼泪白流了。


而提出这个例子不是想抨击什么,而是想引出一个最现实的现状:“众筹,其实是富人的救命稻草,不是穷人的”


众所周知,轻松筹、水滴筹之类的众筹里面的筹款,很大一部分是来自朋友圈的转发。所以你会发现一个问题:


往往是那些并没有那么缺钱的人能筹到更多的钱,因为他们的圈子里都是不缺钱的人,而他们也更懂得如何营销,如何多渠道筹钱。


而在医院中你会发现,那些真正的缺钱治病急需用钱的人,有很多根本就不知道有众筹这个东西。就算发起了,你会发现往往筹的个几万块就已经是上限了,他们圈子窄,更没有人帮忙营销,扩散。


也正因为如此,有很多人为了能多筹点钱,想尽办法的去驳关注。


在这其中,有那种尝到了甜头,不仅想要治病钱还想靠着捐款发家致富的。


还有真的需要钱,乱投医的。


 04 


今天我在微博上看到了一条热搜:转让女儿救白血病儿子!


成都一位31岁的爸爸在医院附近的街头,抱着女儿,面前放着一块求助牌子,上面写着:儿子被确诊白血病,孩子治疗还需要五六十万,转让女儿救儿子......



一石激起千层浪,“重男轻女”“贩卖儿童”种种舆论骂声涌向了这家人。


事后,这位爸爸接受采访的时候后悔不已,他红着眼睛说:当初真的是被逼到没办法了。


但是我注意到了一个细节:他之所以做了这样一个看起来丧心病狂的事情是因为有网络募捐平台的员工,给他支了招。


其实事实不难推测,募捐平台的工作人员告诉这位父亲:你得引起社会关注,这样才会有更多的人来帮助你。


而这位父亲被逼的已经来不及想太多,而他根本不是真的想卖掉女儿,而是用“卖女儿救儿子”这种极富争议的话题来引起话题关注,寻求帮助。


虽然这种方式真的很奇葩,但好在确实给他带来了关注度,现今儿子也获得了一定的帮助。


可是这再一次让大众心凉。


为了救人,走投无路,想要博关注求帮助都情有可原,但是方式却让人觉得“缺德”。你筹了钱救了儿子,可那个被你当做工具,以为自己真的会被卖掉的女儿呢?她的心又会有多凉?


你看,众筹平台上的骗子越来越多,而花式卖惨,博取关注度,消费大家同情心的人也越来越多。


在这背后暴露出了一个很大的问题:“如何才能让大众的善心不被消费?如何才能让那些真正需要帮助的人,在不需要去博关注的前提下,也能获得帮助?”


 05 


看到和肯定有人振振有词:病又不是假的,能筹到款是人家的本事,你管别人有没有钱!


当然,谁都有筹款的权利,但是你可以在信息中标注:我有房有钱,但我想要钱治病。


在这样情况下别人如果愿意捐助你,那就是你情我愿,无话可说。


可重点是,现在那些没那么急需钱的人,文案写的一个比一个惨,花样一个比一个多,他们募捐来的钱,根本就是靠着消费同情心骗来的!


被扒出来后顶多就是退个款,可如果没被曝光,那就在背地里偷乐。


可是看看那些被骗了的人呢?


你觉得一个被骗了一次的人,在下一次碰到类似的事件后,还能有多少人能够无条件的相信,无条件的捐款,无条件的转发?


消费病人,消费死者,利用公众的同情心来换取钱、知名度。大众只会在看到下一则此类消息的时候,为了预防被“骗”第二次,干脆就对此不信、不理、不看。


狼来了的故事不仅仅是童话,从传播学来说,大众总会对于事件的恶性面记忆更深。


就像是在心上刻了深深的一刀,无论过多久,想到了都还是会疼。再遇到相同的情况发生,总还是会心有余悸的。


救了一个人,可却害了无数人。

  

 06 


但是我想我们都知道,这些有钱还在众筹的人永远都不会消失。那在这背后,众筹平台就该付好他们的监管职责。


为什么总是在钱款筹完后才被爆出有房有存款?


众筹平台真的提前做好信息审查吗?


众筹平台帮助了千千万万的人,但也让千千万万人心凉。真正算的上是杀人而又诛心。


但我相信,一切都会变好的。


也希望所有人,能始终用善良去面对每个人。但也请擦亮眼睛,别让善良输给了别有用心。更是拜托有些人,请不要利用别人的善良,去谋一己私利。



逼着大家越来越冷血,只会让世界越来越冷漠,那最后,害的又是谁呢?


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摘在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,牡蛎,稀有鮈鲫和青鳉等[135-141],但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少,河蚬作为中国本土的底栖物种,分布广,敏感性强,易取样,能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs:碱基的数量为18到24,自由能≤-20 kcal/mol,并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs,我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs,以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况,总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取,定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China),定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA),定量引物使用miRprimer软件[146]设计,见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏,但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得,使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜,肌肉,消化腺,性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列,清楚污染的和短序列后,我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads(表2-2)。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列,剩下的4995304 reads(代表16144个 不同的reads)被用来预测保守的和潜在的新miRNAs(表2-2)。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp,占了总reads数的14.4%。同样地,在斑点叉尾(25.8%)[143]和珍珠贝中(34.48%)[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs,我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库,允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来(附录4)。此外,这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数,是最多的,紧接着是miR-184(258355),miR-315(220094)和miR-7(144322)(附录2)。在这些保守的miRNAs中,15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知,所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol(附录3)。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝,15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布,我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地,4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高,然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外,miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言,一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高,接着是外套膜,鳃和内脏团。此外,我们发现miR-12主要在腹足中表达,然后依次是内脏团,鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且,miR-184和miR-10表达水平在鳃,腹足和外套膜中几乎一样,在内脏团中明显低。而在新miRNAs中,Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富,在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高,接着是外套膜和鳃,而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达,但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃,腹足,内脏团,外套膜)的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能,我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件,这款软件允许G=U假阳性,这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人,老鼠,苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言,RNAhybrid是一款简单,快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点,能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3),metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992,miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据,并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达,文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158],David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达,能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达,接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达,仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低, 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29],此外,25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000,绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中,我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs,发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前,人,老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟,无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛,牡蛎,章鱼等海洋软体动物,没有淡水双壳类动物的文献报道,神经肽的毒理学研究也很少,开发河蚬典型神经肽标志物,并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考,运用RACE技术,成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长,对全长序列进行了生物信息学分析,使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响,筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物(北京,中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China)公司; 三氯甲烷,异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life Technologies,USA) Multiskan GO  酶标仪(Thermo Scientific,USA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life Technologies,USA) 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件,Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖,在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集,壳长在1-3cm 左右,年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖,建立一套恒温的流水系统进行养殖,选用水泥池流水循环系统养殖河蚬,以水泵提供流水动力,建有过滤池和养殖池,水经过水泵从过滤池传送到养殖池,再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙,所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水,室内温度使用空调控制,水温保持在20±1ºC,水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h:12h,饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻,或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法,在无菌和无RNA酶的超净工作台进行,具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管,迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液,然后用电动棒碾磨均匀,接着加入冰预冷的800μL Trizol液,注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%,室温放置5min,使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15 秒,室温放置3 min,然后放入离心机,4℃,12000转,离心15min,吸取上层水相,尽量不要将沉淀吸入,移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀,室温放置10min。 (4)12000 g,4°C,离心10 min,弃上清,此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promega

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