回顾昆山龙哥被砍死之前的18年，你就没见过如此的人渣！

来源：天下美食出北京    作者：小愤青儿郭思遥

    看今天这篇文章的时候，大家不要问我龙哥是谁，相信只要会使用手机，会上网的朋友都应该看了龙哥被砍死的视频，不管你看完笑没笑，龙哥真的是死了。龙哥的生命停止在2018年的8月27日，如果实在不知道的请自己百度昆山龙哥。然而27号的这一天，全国的网民都在替被滴滴恶魔杀死的女孩儿惋惜，并没有人关注龙哥。

    我们每个人的生活中会有愤怒、惋惜、怜悯、悲恨。当然还要有喜悦！于是在8月29号的这个晚上，龙哥的死讯横空出世了。与这同一天，最大的新闻只有：天津权健队0比2输给了鹿岛鹿角，演“魏璎珞”的那个演员跟央视耍大牌儿。然而这些新闻的存在，完全比不上龙哥的死讯更能让全网的人民欢呼雀跃。

    龙哥今年36岁，由于我的算术能力不太好，我他妈推算了半天才想明白他应该是1982年生人。如果一个人活好了，可能会有3个36年，一般人至少有俩。唯有龙哥，只活了一个36年，就把自己的生命交代了。

   龙哥的身材很魁梧，看上去要有个将近一米七的个头儿，可能是这些年的生活质量好了，所以在他被砍死的视频里，我们看到他的身材还挺胖。胖了就不灵活了，真的，在龙哥死后，我在网上看了他很多的照片合影，98%以上都是在与人推杯换盏之中。我不知道见天儿喝酒是不是龙哥生活的全部，但我知道，见天儿喝酒肯定胖。

    龙哥的全名儿叫刘海龙，在他36岁英年早逝的时候，我觉得除了怪罪自己当天喝了点儿猫尿不冷静之外，他还应该怪罪自己没托生在柳家，而是托生在刘家。尽管大家在8月29号的这个夜晚，很多人都看过龙哥俯卧撑和踢沙袋的小视频。但是刘海龙和柳海龙的差距，还真不是一星半点儿的。

    龙哥的祖籍是甘肃人，那里是他出生的地方，然而阵亡的地方是在几千公里以外的昆山。要知道龙哥的死，让我们普及了一个新的地理知识。因为如果他不死，我真的不知道江苏有个城市叫昆山。我不知道那里的景色有多美，我只知道那里不少人真的很喜欢纹身和戴金链子。

    龙哥背井离乡很早，不到20岁就已经离开了自己的故土。我不知道他的第一站是哪儿，但我只知道他成名的第一站，是我的家乡。北京市的东城区，就在我家门口儿，在离中南海最近的一个城区。龙哥的故事，就这么诞生了......

    那一年的龙哥应该还未满20岁，那一年的龙哥或许还没有纹身，那一年的龙哥还是靠“手艺”吃饭。他在我的家乡门口儿，凭借他矮小的身材，是馏门儿撬锁，逮谁偷谁。可龙哥算错了一件事儿，正值千禧年，北京又要申办奥运会，我家乡的警察是不会惯着他的。因为盗窃被判处四年半，如果有学法律的朋友或许会知道，这一定是数额巨大了。搁一般偷个电动车，公共汽车上弄个钱包儿，一年半载的也就出来了。可龙哥，干的还是个大案。

    龙哥应该很庆幸，2003年的时候，他没有在社会上浪荡，北京市的监狱那会儿也都在封闭戒严。他躲在全中国最安全的地方，逃避了一场叫非典的灾难。一年半之后，龙哥出狱了，可这时候的北京，或许龙哥真的混不下去了，于是他来到了江苏的昆山。我不知道在这个时候，龙哥是不是在昆山的某个纹身店找了一份工作。因为我知道，哪怕是2004年，北京这边儿的纹身价格也不便宜，以龙哥刚出狱的收入，是不可能在北京纹身的。

    有了纹身的龙哥，或许一发不可收拾，我能猜想到，龙哥或许也会在某个夜深人静的时候，在昆山的某个网吧里，对着网络那头儿陌生的QQ号说上一句：你知道吗？纹身也是会上瘾的！但是龙哥没有说瞎话，他真的上瘾了。他把全身纹的都是花里胡哨的，或许只有这样，才能够在生活中掩饰他身高的不足。不过他的纹身，可能是找了一个叫沈队长的傻逼纹的。很多义愤填膺的人要人肉打沈队长，其实你们真的不用，全中国的纹身圈儿看见他的言论，已经想打他了。

    龙哥在昆山的日子里，真的改过自新了，他想忘掉在北京的那些罪恶。他没有利用矮小的身材，再继续做自己轻车熟路的勾当。不知是什么原因，龙哥居然学会打架了。在他出狱的一年后，龙哥急眼了，跟人动手了，可这次动手，换来的代价仅仅是拘留五日。当时龙哥可能觉得这事儿还成啊，我打了一架，才拘留我五天，比之前关了我四年强多了。

    五天之后，龙哥的名气可就起来了，或许在昆山很多孩子们都在传说着龙哥的事迹：这可是社会大哥，早年进去多少年了，你看人家，这次打架，不就关了五天？！龙哥可能也想过，对自己一直鞭策：低调！低调啊！可谁能经得住金钱与名望的诱惑呢？有了名气的龙哥，玩儿起了诈骗......但是龙哥忽略了一点，这事儿你不专业啊。

    昆山警方也没太惯着龙哥，2007年的3月，又给龙哥关进去9个月。在这一刻，龙哥心里可能想的是：我吃过见过！北京的监狱我都待过了，昆山的又能如何呢？9个月的时间稍纵即逝，龙哥赶在奥运会之前被放出来了。那一年的奥运会，北京城被拆的七零八落，但是治安好了许多，不知道龙哥有没有想回北京看看的欲望，但是回北京偷东西这事儿是不可能了，那一年北京的治安，比哪儿都严。

    龙哥没有回老家甘肃看看，也没有回北京，他在昆山整整的把奥运会看完。那一年的我还年轻，不知道奥运会的项目能不能像如今的世界杯一样赌球。可能龙哥也是赌了什么项目赌输了，当然这是我的猜测.......转过年来的龙哥可不太高兴，我不知道他的酒量如何，但我知道龙哥也是个爱喝酒的人。不知道是喝多了，还是真生气了，也许是赶上那会儿电视里《马大帅》的重播，龙哥学着里面儿的钢子，来了个叮咣打砸，这次砸的还不轻，昆山又判了龙哥三年。

    三年之后又三年，老子有几个三年？你不知道老子最后只活了12个三年吗？所以这次龙哥好好表现了，还争取了减刑，2011年的时候，龙哥只蹲了两年，就被放出来了。当龙哥再出来的时候，貌似昆山地区的混混们，看着这个不到一米七的小个子，开始肃然起敬。龙哥这个名号，在昆山这个山高皇帝远的地方儿，也愈发的火了。

    到了2013年的时候，龙哥觉得自己行事儿了。身边儿也有了弟兄，自己的纹身也是通通透透。他再也不是当年在北京城偷东西的那个小贼了，这一年龙哥31岁了。他对自己的生活，还比较满意，于是他开始忘乎所以，他开始玩儿刀了！当上了刀客的龙哥，很心满意足，第一次出手就扎进了对方的左胸，然而这一次，被害人可能害怕于龙哥的名号，居然谅解了他。

    龙哥也是个男人，他开始迷恋上了歌厅，喜爱上了纸醉金迷的生活。从第一次拿刀扎人之后，可能昆山地区已经容不下他了，整个儿昆山都容不下他，何况一个小小的KTV？龙哥那天又不高兴了，但是这次龙哥没用刀，可能龙哥当时是看上了包房里的烟灰缸，给人家把鼻子打骨折了。

    12年又是一个轮回，从龙哥2001年进监狱，到了2013年，这次昆山地面儿上没惯着他，真给他办了。12年之后，龙哥又进去了。这一年，人们的微信开始普及，不知道当时会不会有龙哥的兄弟发朋友圈儿说：我们等着你回来。

    其实这12年之间，龙哥有七年多的时间都是在监狱里度过。当龙哥的兄弟啊，也挺不容易，老他妈得发朋友圈，当然我不知道龙哥有没有女人。如果有女人的话，她去演个电影都应该是个不错的演员。一遍又一遍的喊着：我等你回来，练也练得动情了嘛。谁说只有一句台词的角色不能出彩？每年夏天你问问监狱里给不给龙哥放西游记看，你问问他喜不喜欢沙悟净？

    2018年的这个夏末秋初，龙哥又喝酒了，他可能觉得整个儿昆山都已经是他的了。龙哥的车想走自行车道那就必须走，可能市长都不敢。他真的没想到一个骑电动车的汉子，敢那么的不卑不亢。在车上，龙哥可能还想着：我出来混也有十七八年了吧，这点儿事儿让小弟解决喽。可狗仗人势的小弟，并没能解决这个汉子，于是，龙哥下车了。

    这些年龙哥一直没有放弃自己的健身，他或许觉得自己一个人可以像叶问那样打十个。可是，龙哥这么多年在监狱，他并没有赶上《古惑仔》那部电影的鼎盛时期，只有在出狱之后看过《叶问》，因为古惑仔里面说过：刀都拿不好，还怎么混？并且他也一定不爱看武侠小说，人家也说了：不会用刀的话，那刀就是别人带的。

    于是，龙哥，卒。

     人们都说这是一个大快人心的日子，但是我并不这么认为。我很不理解如此这般的一个劣迹斑斑的人，他居然能开上宝马，能衣食无忧，还他妈能有钱去歌厅。难道这不是对人们劳动力的一种侮辱和践踏吗？一个人难免一生中会犯错误，但是我相信很多读者如果看过我监狱系列的连载，都会明白，进过一次监狱不可怕！可这种进过好几次监狱的人，他打骨子里就他妈是一个坏透了的人，他真的应该拥有这样的生活吗？

    就包括在朋友圈里悼念他的那群傻逼，我觉得昆山警方应该好好查查，先戴上手铐再查，基本没有冤假错案。龙哥在2018年8月27号的死，我真的不认为是一件可喜可贺的事儿，因为他就应该早死，从北京祸害到昆山，这种人居然还能有朋友，我真想对这个时代说声儿：去你妈的。还有我衷心的祝愿，每一个去参加龙哥葬礼的昆山崽子，他们有朝一日都能暴毙街头，你们多活一天，都是对社会有着重大的危害。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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