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东哥性侵背后的“京东集团与华尔街之战”

陆离人 时局报 今天

文自电影解忧


最近,东哥“在美国涉性侵女大学生” 的传闻火爆朋友圈。


这个事件虽然没有实锤新闻,但不妨碍我们根本历史发展的规律,分析探讨一下未来的可能嘛。


下面就几个问题分析一下。


事件的地点和派对的动机



东哥是在美国豪宅组织派对之后,发生了这件事,据有家媒体报道,性侵的不是东哥本人,东哥是遭受牵连的。


在不知道事情真相的情况下,我们先分析这件事的动机,为什么会组织派对之后发生性侵呢?


组织派对的目的想必大家都很清楚了,拉关系商务合作,来的都是名流嘛。为的是拓展京东的生意和维护人脉。


但是这种上流社会聚集的派对,为啥就和性侵扯上关系了? 这中间有没有什么联系呢?


中国有个四大铁的民谣,“一起扛过枪,一起同过窗,一起分过脏,一起嫖过娼”,认为这几种关系最


靠得住。跟很多人一起做点坏事,比如群P,大家就是战友了,是互相握有把柄,彼此放心的自己人。以后遇到什么事情,这些关系很容易形成商业上的攻守同盟。


大家都很熟悉的海天盛筵,就是一个乱啪派对,而不只是国内,在国外政商界也有很多这种的派对。




众所周知美国人喜欢举办派对,派对形式也是五花八门。除了正常的派对以外,还有各种不一样的派对,比如换装派对,打扮成鬼怪、各种电影人物的造型;比如睡衣派对,每位参加者都穿睡衣入场;比如泳装派对,所有人都穿泳装;比如奇葩的天体派对,所有人都不穿衣服,一丝不挂,受自由奔放的感觉。


而群P派对,这种派对在好莱坞司空见惯,传闻每年奥斯卡之后都有人组织。有些是俱乐部组织的,有些是私人组织的,内容就跟库布里克电影《大开眼戒》呈现的类似,男女戴着面具,自由交欢。当然,这种派对不是想参加就能参加的,参与者都经过严格挑选。


据说不少好莱坞的知名演员和政商大佬都是面具狂欢派对的常客,比如莱昂纳多,还有为数不少的女演员为了寻求刺激也会加入其中;甚至一些开放婚姻的夫妻会结伴而来,然后在派对上各玩各的。据说格温妮丝-帕特洛曾经和男朋友一起参加过,聚会上两人各玩各的,没多久就分手了……


至于场面,大家可以想想电影丁度巴拉斯的《卡里古拉》,《香水-杀手的故事》,库布里克的《大开眼戒》对群啪场面的描述。


而组织这种派对,要么是来拉关系的,要么来找乐子的。大家都带着面具,完全不用顾忌负,一夜之后,谁都不认识谁。




事件的疑点



京东的影响力有多大?


大家不要认为马老板每天出入各个场所占据热点话题,阿里巴巴市场第一,就可以忽略东哥的京东了。


京东是在美国纳斯达克上市的企业,市值最高达到4500亿,拥有员工十几万,同时布局电商,金融和物流三大板块。而且金融和物流给京东贡献的财富比电商高多了,东哥是当之无愧的全球大鳄,京东一个公司的市值甚至超过很多小国家的全国生产总值,属于那种引领全球的风云人物。


这种情况下,东哥要是有事,影响就不是性侵的事情了,最关键的是东哥背后的企业,东哥所拥有的京东系,东哥要被关进去,这种牵一发而动全身的事情,肯定要出大乱子的。


到了一定程度,商业斗争的形式就会复杂多变,衍生到方方面面。


大家没关注到这次新闻中,那个举报性侵的姑娘是如何到达警局,如何面对强大的京东公关,为什么没有被钱收买?




说句大家不爱听的话,能选进这种派对的女士,之前经历绝对不是正义的傻白甜,黄花闺女之类的。要么在一个领域有成就的高知女士,有地位有能力。要么就是纯粹的花瓶了。


而这次性侵的女主角,是明大的学生,相貌吗,只能说普通了。


她如何拿到私人聚会的邀请,假如事情是真的,她如何在性侵之后逃离重重安保的现场,并且去警局义正言辞指正?


东哥这种影响力巨大的大佬出国,身边甚至都会有中南海保镖的,国安也会派人紧跟周围。 苏联以前的女特工燕子,可是利用美色诱惑反水了不少人。各种间谍组织都会使用美人计。


像东哥这种商业巨子的安防工作,一向是国安的重中之重,一旦发生某些事,是会影响国内经济发展的。


一个普通大学生如何绕过重重安保的?如果是普通人,面对这件事如此快速精确的打到七寸,实在说不过去。





京东和华尔街的矛盾



京东不是在国内上市的企业,其主要投资人和股东除了国内的,大多是华尔街的大佬。


之前国内有个著名的事例,马云的阿里巴巴被软银和红杉等国际资本控股,马云不甘心,另起炉灶资产转移,创立了支付宝,气的外国人牙痒痒,但一点办法都没有。


东哥在早期依靠红杉高领等资本给京东发展融资,除了腾讯后来的参投,其公司有好几个大股东坐席都是华尔街的。


看着华尔街最初投了一百万,现在赚了一个亿,还死死握住京东的股权不放手,东哥也得想办法啊,有马云的先例在前,怎么操作的案例都有了。


2013年,东哥成立了京东金融集团,而且为了防止股权没清理干净,在2017年6月,京东金融又进行了一次股权重组。


至于东哥的三架马车之一的物流板块,东哥一直机智的没有成立公司,对外开放,而是以一个独立的事业部在运行。2007年自建物流,2017年4月才宣布成立京东物流集团,隔了十年才成立公司,这是对华尔街的防备有多深?



这两大板块都是2017年重组或者成立的,那么之后发生了什么事情呢?


据高瓴资本2018第二季度持股报告显示,该公司持有京东的股票市值已由一季度的约14亿美元骤减至约7亿美元,持仓比例也从京东2014年上市时的11.32%下滑至今年二季度末的1.47%,且早已退出京东主要股东行列。


重要的是华尔街投行对京东的多空分歧,遭受最重要的战略股东大规模减持。京东的市值今年蒸发离开260亿美元。


其实就是华尔街对京东做空,京东市值狂跌。 东哥这次出国,应该也是试图和华尔街达成一个有限性共识。


但应该在某些关键利益上没有谈妥,导致这场商业战争升级了。


大家如果对商业战争不了解的话,可以多看看这方面的电影。几乎和谍战剧同样精彩,卧底,行刺,美人计,间谍,欺诈等等手段频出。





东哥接下来怎么办???



王思聪对这件事的评价是:“应该是价格没谈妥,送到局里最后谈明白了”


王思聪是万达的太子爷,从小历经商业江湖里的尔虞我诈,第一时间就对这件事有了准确的反应,价格和谈妥两个词是关键。


上文分析了,华尔街和京东的战争,华尔街要的是股权,结果东哥学马云在移花接木。下跌了二百多亿美元抗不住了,来外国和谈。


结果最后没谈拢,出现了这个事情。王思聪给的判断是,送到局里谈明白了。


对一件事情的真相最好判断,不要去看事件本身,看市场反应。


8月31号,事件爆发,京东股价下跌到最低30.76,但收市时逆市反弹,逐渐回升。


按照商业战争的套路,如果明天开盘,股价拦腰齐跌,华尔街空头获利,那么就是没谈拢。


而要是股价平稳回升,那就是谈拢了。



王思聪虽然八卦嘴大了点,但他对于商业的判断很多时候挺准的,嗯,他认为东哥屈服了,最后谈拢了。


至于性侵,咳咳,说了这么多,大家明白性侵不是主要的,东哥脱裤子了吗?我认为没有。


简单的逻辑,东哥见过比这个大学生更漂亮的姑娘吗?奶茶就更漂亮吧。


东哥缺女人吗?有没有更安全的方式呢? 肯定是有的吧,而且他们夫妻感情真的很好。


东哥是弱智吗?不是吧,不会选择在国外,在这种敏感的时刻自己制造个地雷,毁了一切。


那么东哥性侵了吗?


饥不择食寒不择衣的几率,在东哥这里的概率实在太低了啊,这事件发生的有很多疑点呀。

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摘在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,牡蛎,稀有鮈鲫和青鳉等[135-141],但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少,河蚬作为中国本土的底栖物种,分布广,敏感性强,易取样,能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs:碱基的数量为18到24,自由能≤-20 kcal/mol,并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs,我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs,以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况,总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取,定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China),定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA),定量引物使用miRprimer软件[146]设计,见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏,但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得,使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜,肌肉,消化腺,性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列,清楚污染的和短序列后,我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads(表2-2)。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列,剩下的4995304 reads(代表16144个 不同的reads)被用来预测保守的和潜在的新miRNAs(表2-2)。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp,占了总reads数的14.4%。同样地,在斑点叉尾(25.8%)[143]和珍珠贝中(34.48%)[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs,我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库,允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来(附录4)。此外,这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数,是最多的,紧接着是miR-184(258355),miR-315(220094)和miR-7(144322)(附录2)。在这些保守的miRNAs中,15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知,所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol(附录3)。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝,15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布,我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地,4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高,然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外,miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言,一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高,接着是外套膜,鳃和内脏团。此外,我们发现miR-12主要在腹足中表达,然后依次是内脏团,鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且,miR-184和miR-10表达水平在鳃,腹足和外套膜中几乎一样,在内脏团中明显低。而在新miRNAs中,Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富,在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高,接着是外套膜和鳃,而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达,但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃,腹足,内脏团,外套膜)的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能,我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件,这款软件允许G=U假阳性,这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人,老鼠,苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言,RNAhybrid是一款简单,快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点,能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3),metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992,miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据,并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达,文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158],David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达,能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达,接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达,仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低, 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29],此外,25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000,绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中,我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs,发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前,人,老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟,无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛,牡蛎,章鱼等海洋软体动物,没有淡水双壳类动物的文献报道,神经肽的毒理学研究也很少,开发河蚬典型神经肽标志物,并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考,运用RACE技术,成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长,对全长序列进行了生物信息学分析,使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响,筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物(北京,中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China)公司; 三氯甲烷,异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life Technologies,USA) Multiskan GO  酶标仪(Thermo Scientific,USA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life Technologies,USA) 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件,Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖,在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集,壳长在1-3cm 左右,年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖,建立一套恒温的流水系统进行养殖,选用水泥池流水循环系统养殖河蚬,以水泵提供流水动力,建有过滤池和养殖池,水经过水泵从过滤池传送到养殖池,再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙,所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水,室内温度使用空调控制,水温保持在20±1ºC,水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h:12h,饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻,或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法,在无菌和无RNA酶的超净工作台进行,具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管,迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液,然后用电动棒碾磨均匀,接着加入冰预冷的800μL Trizol液,注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%,室温放置5min,使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15 秒,室温放置3 min,然后放入离心机,4℃,12000转,离心15min,吸取上层水相,尽量不要将沉淀吸入,移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀,室温放置10min。 (4)12000 g,4°C,离心10 min,弃上清,此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promega

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