台风山竹爆出最震惊一幕：他们无能为力，只有等死

来源：水木文摘（mweishijie）

人类在自然面前，没有胜利可言，因为每一次胜利，自然界都对我们进行报复。我们是那么需要地球，肆意妄为的同时，却忘了地球并不需要我们。

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最近一周大家都被台风山竹刷屏了。

号称「本世纪最强的超级台风」，山竹的风眼比香港都大，每小时释放的能量相当于2600多颗广岛原子弹，凶猛前所未有。

这么粗壮的大树，轻松松连根拔起。

海南、广东、广西、福建......都受到强烈攻击。

面对自然惊人的破坏力，除了躲起来，像每一次大灾大难前对自然服软，我们根本别无他选。

可是我们又能躲到哪里去呢？“山竹”送了一场飓风暴雨的同时，还顺便甩了人类一记响亮的耳光。

就在“山竹”狂扫香港之后，连番巨浪和海水倒灌进杏花邨社区，海水退去后，出现的画面所有人都愣了。

现场堆满了大量垃圾：泡沫、饮料瓶、鞋子、塑料袋......这些原本被人类丢在海边或海里的垃圾，都被“山竹”冲回了陆地。

很多网友感叹：人类半个世纪扔的垃圾，大自然不过半天就还回来了。

还有人更犀利地发问：这些退回来的东西，会不会再被扔回海里？

台风的形成与人类没有直接关系。但是不置可否，因为全球变暖导致海水温度升高，加速形成水汽和热量，这正是生成台风的关键因素。

如此间接助长了台风的频次和强度，我们还能摊摊手，淡定地说，“山竹”不过是一场天灾吗？

有人说，香港收到的只是人类作恶的“利息”，真正的冰山你从未见过。

深以为然。

当我们对娱乐八卦如数家珍，对奇葩恶搞乐此不疲，却让最该上热搜的他们石沉大海，真正的灾难，已经不远了。

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还记得前不久，那个让朋友圈心碎的故事吗？

一只虎鲸宝宝刚出生半小时就不幸夭折，它的母亲, 顶着它的尸体，带着整个族群的绝望和孤独，义无反顾地游向太平洋深处，久久不放弃，一顶就是17天。

科学家泪奔，全世界网友痛心，这是一场只有母亲能懂的伟大逆行。

虎鲸是濒危物种，近年来数量急剧下降，去年这个虎鲸妈妈的怀孕让科学家们兴奋，这可是过去三年附近族群里的第一个虎鲸宝宝呀。

历经17个月的辛苦孕期，这个来之不易的小宝宝，承载了整个群族的希望的小生命，却在出生1个小时后，就没了生命迹象。

虎鲸妈妈痛苦地哀嚎，久久不绝地回荡在海面之上，外围的科学家们看湿了眼眶，抱歉，这一次我们也无能为力。

接下来的一幕震惊了所有人。

虎鲸妈妈拖着宝宝的尸体，在鲸鱼独有的哀嚎声中离开了群体，头也不回地往海洋深处游去......

24小时过后，当科学家再次追踪虎鲸妈妈的信息的时候，她在顶着宝宝的尸体，不进食不休息，持续前行......

48小时之后，人们在另一片水域发现，虎鲸妈妈居然还带着宝宝在前行!!!

这一切都太不符合常理了！

一般情况下，如果宝宝夭折，母鲸都会毫不犹豫地丢下孩子。

这并非冷血，而是动物的生存本能，否则她们会跟不上自己的群族，在茫茫大海中陷入危险。

她是不知道小虎鲸已经离去的事吗？她怎么会不知道！

在前行的途中，每次宝宝从她的头上滑落，虎鲸妈妈都要6-7次深呼吸，再能进行一次长时间的深潜，去把宝宝捞上水面...

科学家在接受采访时潸然泪下：

她从一天开始就知道孩子已经死了。但是她选择不相信，执拗地顶着宝宝前行。

海洋是她们的家呀！在海里出生，在海里长大，也许游着游着，鲸鱼宝宝就可以在海中活过来......她在等待奇迹，孩子，求你别放弃，求你醒过来。

她无法特意觅食，因为一旦分神，就可能永远失去自己的孩子。她只能带着孤注一掷的希望和痛彻心扉的绝望，用几乎绝食的方式，一刻不停地顶着自己的宝宝在海里不停地向前。

就这样不断重复着顶住，滑落，深潜，打捞，再顶住...等人类再次追踪到她的时候，虎鲸妈妈已经这样昼夜不停地奔波了一个多周，她的行迹已经穿越了整片海域。

她渐渐消瘦，甚至变得恍惚，体力明显不支。科学家们心急如焚，但是谁都不敢从这只几乎崩溃的母亲身边，带走她的孩子。

一位接受采访的科研人员哭成泪人：

“这是动物界的奇迹。就算它愿意冒险脱群，在长时间不进食的情况下身体也是极度危险，它可是刚生产完啊...”

渐渐地，虎鲸妈妈的身边，出现了很多守护她的同伴，游在她的周围，护她一路平安。就这样，虎鲸们集体对抗着动物本能，陪伴着这个悲伤的母亲在大海里悲鸣前行。

谁说动物就没有感情？她们和人类一样，同是母亲和亲人，爱足够战胜冷血的本能。

虎鲸妈妈的身体越来越虚弱，她的动作越来越艰难......终于最后一次，在她再一次尝试托举的时候，再也没能够成功。

17天，游了超过1000英里后，虎鲸妈妈，彻底失去了自己的孩子。

虎头鲸怀孕周期通常有17、18个月，比人类还长，它们对后代的爱，可能不会比人类少。

你已然为人母，你或将成为母亲，我们都有母亲，痛失爱子，悲痛欲绝的心情里，谁人都可以体会。

曾经看到过一对夫妻为出生三周就夭折的孩子写的墓志铭，短而戳心：

“墓碑下是我们的小宝贝，他既不哭也不闹，只活了二十一天 ，花掉我们四十块钱。他来到这世上，四处看了看，不太满意，就回去了。”

与这世界匆匆而别的鲸鱼宝宝，你一定也是不喜欢这世界，所以选择到另一个天堂去了对吗？

科学家们捶胸顿足，杀死鲸鱼宝宝的，根本就是人类这个刽子手。

虎鲸一直以来都是海洋中的霸主。它们遨游了几百万年，位于食物链的最顶端，在自然界中没有天敌，寿命极长。但是近些年来，人类过度捕捞，把虎鲸的主要食物来源三文鱼，一网打尽。

很多虎鲸甚至可能一连几天都找不到食物，在百万年中，这些海洋霸主，第一次被饥饿折磨到几乎灭绝。

是的，鲸鱼宝宝，这个世界已经配不上你的爱。

即使能活下来，它或许不用等到长大，又会再度跌入人类魔爪。因为我们正在把地球毁灭到面目全非。

⒊

水木君知道很多人会说，小虎鲸不是直接死于人类的屠刀，夭折不是人类的锅，我们的手上不曾沾满鲜血，那么看到下面这些，铁石心肠的人会不会为之动容一点点？

那么可爱的小企鹅，身上却沾满了人类泄漏到海里的原油，它们无法给自己清洗，只能任由毒素侵入自己的身体，慢慢死去。

海狮的鼻子被食品罐紧紧的套住，不管如何努力，它自己都无法摆脱掉，它会被活活饿死，或者成为别人的猎物。

这只鸟类被人类乱丢的塑料袋包裹住，它再也飞不起来了。

被塑料套住的海龟，身体已经扭曲到变形，日渐勒紧的项圈让它的生命进入倒计时。

小海狮被层层叠叠的捕鱼网绊住，无助地哀嚎。

塑料网和钓鱼线一旦缠绕在动物身上，80%的可能性会直接导致伤害和死亡，它们无法顺利进食，浮出水面换气，甚至直接窒息。

谁不想活下去呢。人类求求你放我们一码。

太平洋小岛上，数万信天翁接连死去，人们在他们的肚子里发现了这些。

动物们会误把漂浮的垃圾当作食物，源源不断地吃进塑料，这可能导致肠阻塞，溃疡，胃穿孔，最后只剩死亡。

除了直接的伤害之外，这些塑料还会产生虚假的饱腹感，导致动物们停止繁殖，最终饿死。

傻瓜，你们为什么要吃？吃了就没命了啊！

这些残忍的照片，照出每个人最惭愧的一面。

它们拼死挣扎，它们不知道发生了什么，它们什么都没有做错，可是它们却都要死了......

2002年到2012年间，人类产生的塑料垃圾比整个20世纪都要多。每年排放的3亿吨塑料根本无法降解，最终只能排入大海不予治理，这些垃圾被成千上万的海鸟、海龟和其它动物吃掉。

据统计，全球至少一半的海龟体内有塑料，大约60%的海鸟在某种程度上吃过塑料碎片，到2050年，这一数字将增加到99%。

更不必说，早就出现的全球变暖，南北两极的冰川融化。

绝望的北极熊妈妈抱着孩子，他们不知道下一个家身在何方？北极圈里的苍茫大海竟没有几块能够让它们休憩的冰块。

更多的北极熊被活活溺死和饿死。

南极大陆上企鹅成片死去。

人类自己造成的恶果却要它们去承受。我们随手丢的垃圾，却毁了它们一生。

⒋

水木君知道，有人仍然要说，我们吃喝玩乐，这些动物的生死跟我们有什么关系？

可是你不知道的是，它们的今天就是我们的明天。残忍的照片只是一个警钟，大自然早已开始了对人类的无声反击。

塑料垃圾在海洋里被慢慢分解成细小的颗粒，被鱼类吃下去，最终会进入人类体内。我们扔出的垃圾，正在被我们一点点吃回去。

因果循环，不寒而栗。

那不吃鱼不吃海鲜不就行了吗？很遗憾，更可怕的并不是食物本身。

科学家们的估测，如果全球变暖加剧，南北极的冰川继续融化，全球的海平面上升上升将近70米，到时会淹没绝大部分沿海城市。

70米是什么样的概念，意味着海拔低于这个高度的城市：北京、上海、广州、深圳、武汉、南昌、济南、江浙沪、港澳台......全都沦为汪洋，我国9大粮食产区被淹没6个......

不仅如此，还记得我们被非典完虐、被埃博拉和疟疾吊打的失控局面吗？如果南极融化，会把冰层下冻土里储藏的史前病毒，完全释放出来，那也许是这些瘟疫般的疾病加起来都闻风丧胆的噩耗。

家园被淹没，没有食物，饥荒、疾病、生态彻底失衡，当生活变成了流离失所的逃难，你还能无动于衷吗？

正如一句公益片里说的，大自然不需要人类，但人类需要大自然。

这世界存在了几十亿年，人类只是初来乍到。我们永远不该试图征服自然，因为我们只是它的匆匆过客，对于地球，人类根本不足挂齿。

听闻小虎鲸和妈妈的悲歌，你可以冷漠地说关我屁事；

面对数以万计的动物活活死去，你依然可以冷血地不理不睬；

但是我们的存亡都成为一个选择题的时候，请你停下来反思下自己吧。

你要爱自己，爱家人，更要用力爱这个世界。皮之不存毛将焉附啊，保护它们，就是人类的自救。

否则，时间会把我们欠下的对不起，变成还不起，又会把很多对不起，换成来不及。

别再一边感慨流泪，一边当着罪魁祸首，保护环境，爱护生态不是一句口号，只有行动才拥有改变的力量。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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