山竹走了，还狠狠地甩了我们一耳光！

来源：电影铺子（movpuzi）

台风“山竹”总算过去了。

不过，在它走时，还不忘狠狠地甩我们一耳光！

没错，铺子指的就是台风留下的海洋垃圾。

白色泡沫、塑料瓶、塑料袋。。。。

其实，这是意料之外、情理之中。

用网友的说法，这些塑料垃圾其实都是海洋还给人类的。

而且，这些只不过是冰山一角。

如果海洋一次性把大海里的塑料垃圾都还给人类，我想没人能承受。

或许，不少人听说过太平洋垃圾带，即地球的“第八大陆”——在美国加利福尼亚和夏威夷之间的太平洋水域，堆积了8万吨塑料垃圾。

这些垃圾的覆盖面积超过160万平方公里，相当于我们的新疆那么大。

如此规模的垃圾，人类要怎么处理呢？

一切，要从源头说起。

《塑料海洋》

这是两年前的一部纪录片。

导演奔波于世界各地，拍下了塑料垃圾对海洋造成的不可逆的污染。

有哪些污染呢？

最直观的就是漂浮于海水中的脏、乱、差了。

上一秒，我们沉浸于蔚蓝海水中幼年蓝鲸的优雅体态。

一个字，美极了。

下一秒，镜头一转，就在蓝鲸不远处，是漂浮的各种塑料垃圾。

其中，这些塑料周围还浮着一层淡黄色的油脂。

一个字，很恶心。

在这样脏的海水中生活，这头小蓝鲸能健康平安地长大吗？

我想是很难的。

海水变得不“美观”只是一面，塑料垃圾还可以直接杀害海洋生命。

我们看到：

一只海豚被塑料袋缠住了嘴，它奋力地扭转身躯想甩掉它，却怎么也办不到。

一只海狮的脖子被塑料袋类勒出了深深的血痕。

很显然，这是它小时候就被套上的塑料袋。

一只海豹在水里被渔网缠住了脖子，它很努力地把头抬出水面呼吸。

如果没人解救，它能坚持多久呢？

一旦被塑料缠身，很多动物都是死路一条。

要么你直接被活活勒死，要么身体慢慢被勒变形，落下残疾。

不仅如此，有些塑料还可能直接被动物们吃了。

吃塑料，无疑就跟吃毒药一样。

但，动物们怎么可能知道呢？

巨大的布氏鲸的进食方式是张开大嘴吞食一切。

如果进食区域漂浮着大量的塑料，那它一口下去，吞进肚里的肯定少不了。

这些塑料是消化不了的，它们会慢慢累积在鲸的肠胃里。

久而久之，鲸开始吃不进东西，也拉不出东西。

就这样，它被塑料活活“堵”死。

布氏鲸的进食方式让它无法过滤塑料，而一些小动物，却无法分辨塑料是否可食用。

比如海龟。

有些海龟是以水母为食，而飘在水中的塑料和水母非常像。

它们就会把塑料当做水母，津津有味地一口一口吃下去。

纪录片中，最让人铺子印象深刻深刻的是一只小海鸟。

它还不会飞，靠父母养活。

但，它是吃什么成长的呢？

海鸟专家给它洗了一次胃。

结果发现，胃里的食物简直恐怖——满是油污和塑料。

而就在它的旁边，很多成年海鸟已经被塑料撑死了。

解剖发现，它们的胃里全是塑料。

其中，有一只雏鸟体内的塑料有276块，重量是体重的15%。

毫无疑问，一直吃塑料，这些雏鸟是永远也不可能再飞起来的。

这些年，许多海鸟尸体都有一个明显的特征。

那就是尸体腐烂分解了，体内的塑料却依然鲜艳夺目，完好如初。

而这些塑料，很有可能又会被下一只无知的海鸟吃进肚子。

它们根本不知道这些红红绿绿、颜色鲜艳的东西不能吃。

从开始肚子痛到咽下最后一口气，它们肯定也不明白自己究竟吃错了什么。

可以说，海洋垃圾已成为海洋最危险的存在。

而且，它的危险绝不仅仅只对海洋。

以上内容，垃圾的受害者只有海洋动物，好像和人没关系。

事实当然不是这样。

有人说，“山竹”是一次垃圾回城的警示。

然而，人类丢入海洋的垃圾，其实早已回城了。

目前，海洋中大约5万亿塑料，其中高达90%都是塑料微粒！

塑料微粒的一个去处，就是浮游生物。

浮游生物被小鱼小虾吃，小虾小鱼被大鱼大虾吃。。。

如此，食物链会让塑料微粒层层上移，最终来到顶端——人类。

12年，台风维森特席卷香港。

码头集装箱上的塑料原料胶粒被吹进海洋，有的飘到了附近的渔场。

台风过后，在渔场随意打捞的鱼的体内，就发现了不少塑料微粒。

稍不注意，这些塑胶颗粒就会被我们吃了。

除了鱼，其他很多海鲜也有可能含有塑料微粒。

有专家曾在法国的一个贻贝养殖场做抽样检查。

结果发现，每一个贻贝都含有塑料微粒。

而我们吃贻贝喜欢整个吞食，吃下的到底有没有塑料，一般很难发现。

所以，我们随手扔掉的塑料，很有可能绕一大圈又会回到你身边。

甚至，有的会直接成为你体内的一部分。

面对这样的现实，我们该怎么做呢？

首先，肯定是要先把垃圾从海里打捞起来。

海洋如此巨大，塑料垃圾又是以微粒为主，一直以来，打捞都非常困难。

目前，除了常见的人工打捞之外，方法主要是海洋垃圾桶“SenBin”和巨型漏斗“The Ocean Cleanup”。

海洋垃圾桶利用水泵的吸力，将海水及悬浮的海洋垃圾吸入天然纤维袋里。

最后，垃圾被留下，而海水经过过滤再排出。

巨型漏斗则是利用洋流自身的动力。

在海面上，用漂浮栅栏排成一个“V”形缓冲区。

跟随洋流而来的海洋垃圾就会被缓慢截下，再进行打捞。

这两种方式都不错，但面对如此多的海洋垃圾，一时半会儿很难有大的效果。

更重要的是，人类无时无刻不在生产、使用、丢弃塑料用品。

所以，解决海洋垃圾问题，还得从源头入手。

目前，世界上完全禁止使用塑料袋的国家只有几个，而且多数是在非洲。

2017年的数据数据

非洲国家人数不多，经济落后，本来使用的塑料制品就不多。

而亚洲、欧美才是塑料大国。

纪录片里有一个特别的提醒：当我们看到16分钟的时候，（这16分钟内）全球已经生产出了9534吨塑料。

其中，塑料袋不仅生产得多，而且用得很快。

毕竟，它当年的宣传词就是一次性嘛，快捷、方便。

所以，每一个塑料袋的平均使用时长只有12分钟。

数据显示，平均一个人，一年将使用并丢弃136公斤的一次性塑料制品。

而以上这些，还不是海洋“微粒塑料”的源头。

海洋微粒塑料的污染源，其实离我们更近。

它存在于我们的沐浴露、牙膏、磨砂洗面奶等等很多类型的洗护产品中。

目前全球含有微珠的洗护产品共有1147种，光是普通的一瓶磨砂洗面奶中就含有33万颗塑料粒子。

而这些微小颗粒很容易就进入下水道、河流、湖泊、海洋。

到最后，它有可能又会以另一种方式回来。

出来混，迟早是要还的。

所以，我们要怎么混才能在还的时候，轻松些呢？

首先，我们要少用或不用一次性塑料制品。

比如塑料袋，我们可以就可以用纸袋或布袋来替代。

或者，用一个能满足就不要用两个。

其次，我们要延长塑料制品的使用时间。

比如，买菜的塑料袋不是直接变成垃圾而是变成垃圾袋。

第三，我们要拒绝使用带有塑料微粒的洗护用品。

在美国，从2017年7月1日开始，将禁止生产和销售包含塑料微粒的香皂、牙膏、以及身体乳等产品。

而我国目前还没有相关的法律，不过，这确实已经可以提上议程了。

在这之前，我们只能自己区分了。

第四，我们一定要做好垃圾分类。

这样做，是为了更方便于回收利用，降低污染。

处理垃圾本来就不容易，所以我们从第一步就让它简单一些吧。

最后，想提一句，这部片子的制片人是莱昂纳多·迪卡普里奥。

我们都知道他是有名的花花公子，是一流的演员。

但，或许很少有人知道，他也是一位积极的环保主义者。

早在1998年，24岁的时候，他就创立了自己的公益基金会，致力于支持环保项目。

20年来，他出钱出力拍摄了多部环保纪录片，比如《第十一个小时》、《洪水泛滥之前》、《象牙游戏》、《奶牛阴谋：永远不能说的秘密》、《维龙加》等。

为什么要不断拍摄环保纪录片呢？

我想，其实理由很简单。

因为，不少人可能觉得，垃圾出了我的门，就和我无关了。

而且，许多人对身边很多潜在的污染并不知情。

这时，就需要有人来提醒：垃圾、污染离我们真的不远。

所以，影片的目的很单纯：为了让更多人了解污染近在咫尺。

因为，了解伴随着关心。

而关心，则孕育着改变。

我们，需要改变。

点击下列标题，您可以阅读更多精彩文章：

摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

时局报报道当前时局关注