高铁“霸座男”的事件尚未平息，昨天又出现了一个“霸座女”。
据报道，9月19日上午，从永州到深圳北G6078列车上又现霸座行为。
一位女乘客在上车后未按照车票位置就坐，坚持要坐在靠窗的位置上，车票座位靠窗的乘客向列车乘警投诉，但经过乘警与霸座女乘客的反复沟通，这名女乘客始终不肯让座。
来看看整个过程：
最终结果是，原来合法拥有该位置的乘客，被迫换到别的位置上。换句话说：霸座女用无赖的方式取得了胜利！
不让坐高铁又怎样？我还有轮椅啊
来源：军武次位面（junwu233）
▲近日又出现的霸座女
其中一个是在高铁上占了别人靠窗的座位，不过这回没有学霸座男“装瘫痪”，而是直接“装傻”。在面对列车员耐心解释和劝说下，该女子却一直胡搅蛮缠，并不断叫嚣：“车票上写我名字啦，没写应该坐在过道呀”。最后该女子被罚款200元并被铁路系统拉入“黑名单”六个月作为处罚。
▲火车上的霸座婶
而另一位在普通火车上占座的霸座婶的言行更加气人，不仅霸占了别人的座位，还摆出一副倚老卖老的架势，不仅不接受列车长的教育，还要摆出一副“过来人”的嘴脸反过来“教育”被占座的小伙：“我上车的时候空位比较多。
虽然这是你买的票，但是你是年轻人，站半个小时没问题。我最看不惯你们年轻人了，缺乏教育。我年轻的时候让座多了去了。” 小伙子说这是我买的坐，大妈居然说活该你倒霉！
▲我真想上去一耳光抽飞她
长这么大，能够把自己的无耻说得如此理直气壮毫不心虚的人军武菌也是头一次见，虽说林子大了什么鸟都有，但这样的无赖到了其他国家会享受到什么样的待遇呢？毕竟在国外可没有人会“惯着”这群人。
在国内，不论是火车上的工作人员还是处理类似事件的警察在这些无赖们做出过激举动前都不会选择强行将其带离座位，多会选择耐心劝说和教育，但国外的警察往往就没有这个耐心了。
▲警察在要求其离开遭拒后强制将其拖离其座位
之前在美国曾有一名奇葩的黑人女子，在坐飞机时先是在值机柜台跟工作人员为行李托运费不停争吵，上了飞机后又不断做出许多怪异的举动影响周围的乘客。
在乘务员过来制止她的奇葩行为时，她认为自己受到了歧视，于是开始于乘务员争吵，无奈之下机组人员叫来的警察。可是该黑人女子留在自己的座位上不愿意下飞机，并继续向警察咆哮。最后两名警察强行将该女子抬下飞机。
▲女子被带离飞机时，机上乘客自发鼓掌欢呼
在被从座位上拉出来的过程中该名女子不断挣扎尖叫，但两名警察不为所动，在该女子快被拖离飞机时，机上的其他乘客爆发出了热烈的掌声“欢送”这名黑人女子，整个机舱中顿时充满了欢乐的气息。
▲警察一开始并没有直接介入这起家庭纠纷
类似的美国警察强硬执法的案例还有不少，曾经一名黑人男子喝高了，在与其抱着孩子的妻子争吵，起先警察只是站在一旁，没有采取行动，但接着该男子越来越激动，开始于他的妻子有了肢体接触，原本站在一旁的警察快速上前将该男子与其妻子隔开，并用手推着黑人男子示意其退后。
▲警察迅速上前将二人隔开，同时用手将男子推开
但这名男子不退反进，不仅身体继续向前，还将手搭上了警察的胳膊，想要将警察的手推开。可这一举动就好像踩到了地雷，原本这是将两者隔开的警察瞬间出手，将该男子放倒在地。这时如果男子停止反抗，警察给其带上手铐后事情也就结束了，可该男子被放倒后继续拼命挣扎。
▲男子的都刚搭上警察的胳膊，警察就出手将其按到，
同时另一名警察默契的将一边的小女孩牵走
面对该男子继续反抗的行为警察马上提升了武力等级，开始挥拳猛击该男子面部。一顿老拳下去之后该男子终于老实了。
▲黑人男子被警察爆锤头部
明明是警察先动手推的黑人男子，黑人男子“还手”却被暴打，美国的警察在面对反抗执法时就是这么“暴力”。如果该男子在被打后继续反抗，美国警察还可以继续提升武力等级，那时候他要面对的也许就不是砂锅大的拳头，而是警棍和电击枪了。
执法时的美国警察就是法律的象征，“我可以动你，但你不能动我”就是他们的准则，在执法中任何威胁警察安全的行为都会成为你被“暴打”的理由。因此美国大部分的被执法人在面对警察时都会选择秒怂，不然被打了也是白打。
正是由于美国警察在执法时对于抗法者的强硬，让那些喜欢无理取闹的无赖们在美国没了生存空间，而其他守法守规的普通人的合法权益也得到了应有的保障。
▲警察在执法时被暴力抗法者扇耳光已不是个案
反观国内，早些年警察在面对一些无理取闹甚至是暴力抗法的嫌疑人往往会选择忍让，而如今社会上各种类似“霸座”的无赖现象层出不穷，一个很重要的原因就是这些人违法违规的成本太低，将警察对他们的忍让当做了他们耍无赖的资本。
警察在面对这些抗法者时很多时候都是“打不还手，骂不还口”，虽然最后这些暴力抗法者都受到了法律的制裁，但警察作为执法者的尊严却被严重损害。难道我们的警察就真的是“软骨头”吗？
▲为了自证清白，面对下跪的被执法者
警察也只能对跪以证清白
其实问题的根源还是在中国警察的执法环境上，尤其在早些年，各种以“警察打人啦”为噱头的警察执法视频充斥网络，许多原本是正常执法的视频被人恶意剪辑后就成了攻击警察暴力执法的“炮弹”，每次这样的视频出现都能引起许多键盘侠在后头跟风侮辱谩骂，而警察在执法中所要面对的舆论压力也成倍增加，面对一些无赖，宁可自己受委屈，也不愿合法使用武力。
由于无脑的跟风舆论而导致警察在执法中投鼠忌器的情况可不是中国独有。去年一月份时，澳大利亚墨尔本有一名瘾君子在嗑药后劫持了自己的女友，并驾车在大街上冲撞行人，造成了5人死亡37人受伤，死者中还有一名仅三个月大的婴儿。但最让人震惊的是，该罪犯在大街上横冲直撞了5个小时，可警方却始终没有开枪将其击毙。
▲慌乱中跑进便利店躲避的民众
其原因就是在十几年前澳大利亚曾发生过类似的案件，当时那名嫌疑人也是嗑药后在大街上冲撞行人，当时的澳大利亚警察果断将其击毙，因此没有人在那次事件中伤亡。
但警察的举动在事后遭到了那些“圣母”们的一致谴责，认为警方的行为太暴力，在嫌疑人还没有造成严重后果前就将其击毙是不人道的，警察应该将其逼停而不是直接击毙他。最后此类的言论成了舆论主流，参与行动的特警还受到了调查。
▲面对这样疯狂的歹徒，
曾经的“圣母”酿成了今天的苦果
吃过这些白眼狼的亏的澳大利亚警察这次干脆连驾车拦截都不做了，最后导致了重大伤亡的发生。而事后却又被骂了，这回的理由是不作为。横竖都是被骂，你们这帮“圣母”到底想怎样？
做不做都被骂，这样的境遇与几年前的中国警察何其相似，都是在执法中承担着巨大的舆论压力，并且在舆论压力下投鼠忌器，而如今面对社会上出现的“霸座”现象时，批评中国警察执法不够强硬的声音又成为了主流。
▲执法记录仪的装备是规范化执法的重要一环
好在这些年通过对执法程序的程序化规范化，尤其是执法记录仪的大规模装备，让我们的人民警察在执法时更加放得开手脚，也能更好地做到严格执法，从而更好的保障守法公民的合法权益。对于中国警察的“教科书式”的执法过程，我们在之前的文章《中国56冲曾把美国警察打到绝望！美国的执法环境有多危险？》中就有提到。
▲面对执法记录仪，在厉害的无赖也无所遁形
合理执法高效执法的责任并不仅仅是在辛勤付出的警察身上，也在我们每一个普通人身上，在面对那些恶意挑拨警民关系的事件时，能够多一份理性的判断和思考，而不是无脑的跟风谩骂，才是对警察执法的最好支持。有了这份支持，将来警察在整治这些无理取闹暴力抗法的霸座无赖时，才能放得开手脚，从而让我们每个守法守规的普通人的权益得到保障。
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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega