瑞典，曾经地球上最慷慨的国家，终结了

文：假装在纽约（mr-jiazhuang）

1、前不久瑞典刚刚举行了大选。

这次选举，全球主要媒体都给予了高度的关注。选举前就派出记者采访，选举结果明朗后更是推出各种分析文章。

对于瑞典来说，这是很不寻常的待遇，这样的关注度以往从来没有出现过。

瑞典偏居北欧一隅，社会和经济发达，同时又有很完善的社会福利制度，和其他北欧国家一样，堪称世界发展的楷模。

但是，瑞典太小了，虽然国土面积有45万平方公里，但人口只有950万，还不到北京的一半。用中国的标准来衡量，也就是个稍微大一点的地级市的水平。

首都斯德哥尔摩，全国最大的城市，不过只有95万人。

所以，虽然瑞典高度富裕文明，但他们在世界上的影响力着实有限。估计一般人对于瑞典的印象仅限于宜家、肉丸和拉尔森。

对于瑞典的政治，外界本来是不会有太大兴趣的。

但今年的情况很不一样。

瑞典第一大党叫瑞典社会民主党。

这个党的政治立场是中间偏左，他们奉行社会民主主义，既遵守自由市场经济，又希望借助社会福利手段保证社会平等和弱势群体的利益。

所以瑞典这样的高福利资本主义国家，有时候看起来反而更接近社会主义国家。

瑞典社会民主党从1889年成立以来就长期执政，历史上只在几个短暂的时期失去过执政地位。目前他们和另外几个中间偏左的政党组成了中左翼联盟。

而和他们相对的，则是中右翼联盟，同样由几个政党联合组成。

原本瑞典政坛的格局就是执政的中左翼联盟和在野的中右翼联盟对峙。

大家其实都走中间路线，只不过是略微偏左和偏右的区别，彼此之间的对抗性也不是很强烈。

但这一次选举，一个不同寻常又让人不安的变化是，奉行民粹的极右翼政党“瑞典民主党”迅速崛起，眼看着就要成为撼动瑞典传统政治格局的第三极力量。

他们的党魁伊米·奥克松(Jimmie Akesson)风头很劲。

我们知道极右翼势力崛起不是一个孤立的现象，而是一个全球性的趋势。

西欧南欧国家出现极右翼势力还能理解，但瑞典社会向来开明，这一次浓眉大眼的他们会叛变革命吗？

因此瑞典的变化就让国际形势观察家们感到异常紧张。

大家都在好奇又不安地关注：到底会有多少瑞典人给极右翼的民主党投票？

2、每个国家极右翼的崛起都有各自的原因，在瑞典这要追溯到2015年那场让整个欧洲头疼不已的叙利亚难民危机。

如果你还有印象的话，会记得当时大多数欧洲国家都对难民避之不及。

很多国家，允许难民穿过自己的国土，但决不允许他们做任何的停留。最极端的匈牙利在国境建起了铁丝网。

匈牙利政府还在阿拉伯语媒体登广告，警告难民不要试图跑到匈牙利。

就连丹麦都通过了一部引起很大争议的法律，规定难民一旦进入丹麦，所有财产会被强制没收用于支付遣返费用。

瑞典是匈牙利的反义词，他们是除了德国以外唯一一个张开怀抱热情欢迎难民到来的欧洲国家。

不光是瑞典政府，那时普通的瑞典人，都认为应该对难民提供基于人道主义的帮助。

有这样的反应并不奇怪，长久以来瑞典一直是地球上最慷慨、最有同情心、最有理想主义情怀的国家。

我记得有美国记者这样形容：“瑞典是唯一一个我遇到的每一个人都比我更理想主义的国家，每个人看上去都如此冷静镇定、积极乐观、整洁有条理”。

所以，瑞典一直也是最欢迎难民的国家。

二战的时候，瑞典人就收留了大量的挪威人和丹麦犹太人。

再后来，逃离伊朗的伊朗人、逃离皮诺切特独裁统治的智利人，还有厄立特里亚人、索马里人、库尔德人，都来到瑞典落脚。

90年代，前南斯拉夫解体，瑞典又收留了10万来自前南国家的难民。

有统计显示，每年瑞典接收的难民大概是8万人，按人口平均的话这个数字是非常可怕的。美国人口是瑞典的35倍，但每年瑞典接收的难民数比美国还要多。

“接收难民”，是瑞典人生活的一部分。而难民们安顿下来以后也慢慢地融入了瑞典，成为瑞典这个国家的一部分。

所以这一次，瑞典人带着理想主义，以为他们可以继续以前的做法。

就这样，在其他国家都关上门的时候，叙利亚难民迅速地涌进了瑞典。

一开始，每个星期都有1500名难民来到瑞典寻求庇护。到了8月，数字开始翻番。到了10月，瑞典每周接收的难民达到了1万人。

按照这样的速度，预计2015年全年接收的叙利亚难民总数将达到19万人，相当于人口总数的2%，按人均来说远远超过德国。

这样的规模，很快就超过了瑞典的承受能力。

短短几个月之间，全瑞典所有的私人收容机构都满额运转，宾馆、兵营、教室、停车场、体育馆都被临时征用，搭建了白色的安置帐篷。

瑞典这么大，但再也没办法多放下一张给难民的床。

让人佩服的是，即使在这样的情况下，瑞典难民署设立的登记现场仍然井井有条，和其他国家难民接收的混乱局面形成鲜明的对比。

而且瑞典人在审核难民资格的时候非常宽松。

未成年难民的申请一般会无条件地批准，但问题是很多人身上并没有任何能证明身份的文件。

其他国家会对难民做骨龄测试，但瑞典的医生却拒绝这样做，理由一是骨龄测试不精确，二是会侵犯隐私。

于是，难民自己说几岁就是几岁，即使看上去明显30岁、40岁但仍然声称未成年的，瑞典官员也不去戳穿，只是要求他们不要和真正的未成年人睡在一起。

就算是那些因为各种原因不符合瑞典难民接受标准的人，瑞典政府也不会真的下功夫赶走他们，只要他们自己能找到住的地方，基本上就被默许留下来。

按照瑞典政府的规定，难民获得国民待遇，享受和本国公民一样的住房、医疗、教育、产假、失业保险等福利。

拿产假来说，瑞典法律规定了450天带薪产假。对于难民来说，只要孩子还在7岁以下，母亲即使没有工作，也同样能享受这450个工作日的产假。

这意味着她们只要来到瑞典，就可以连续好几年不工作，每个月还能拿一大笔钱。

2015年，瑞典政府开支预算的7%都用在了安置难民上，这还不包括难民以后教育和培训的费用。为此，瑞典不得不削减了30%的对外援助。

难民，成为了瑞典人给自己设置的一道无论如何作答都无法找到正确答案的无解难题。

于是，普通瑞典人对于难民的态度发生了变化。

民意调查显示，认为应该暂停接收难民的受访者比例，在几个月里从34%大涨到了60%。

围绕是不是应该继续接收难民而形成的争议，也造成了瑞典社会的痛苦撕裂。无数的家庭内部，无数的朋友之间，人们热烈地激辩，谁也无法说服对方。

2015年11月24日，曾经慷慨激昂宣称“我心目中的欧洲从来不会修建围墙”的瑞典首相洛夫文(Stefan Löfven)不得在新闻发布会表示，将采取措施限制接收难民的人数。

他带着哭腔说，“要这么说我非常痛苦，但瑞典再也无力接收这么多的难民，瑞典人也需要呼吸的空间”。

他身旁的女副首相，同样也是眼眶红红，流着眼泪。

到12月，瑞典宣布不再接收任何没有身份证明文件的难民。

原本按照申根协定，在申根国家之间出入境不需要出示身份文件，因此这个新规定意味着申根协定的自由流动原则终结。

到了2016年1月，瑞典政府又宣布将强制驱逐8万名已经入境的难民。

对于原本善良慷慨的瑞典人来说，要这样硬心肠还真不是一件容易的事。

瑞典人就这样被自己的理想主义情怀压垮，地球上最慷慨的国家到此宣告终结。

当然，指责瑞典人是不公平的，没有任何一个人有资格要求别人去当英雄。

如果当初其他的欧洲国家也能够伸出手接收一定数量的难民，而不是关上大门把包袱甩给少数几个国家，那瑞典肯定就不会被压垮，只是可惜没有如果了。

3、难民潮虽然得到了遏制，但它给瑞典社会留下了持久的影响。

最直接的表现，就是这次的大选。

最后的选举结果，执政的瑞典社会民主党只拿到28.4%的选票，创下了100年以来最差的表现。

中左翼联盟的选票加在一起是40.6%，中右翼联盟则是40.3%，都没有过半数。

而极右翼的瑞典民主党得票率17.6%，虽然没有像事前人们估计的那样超过20%，但已经比四年前他们的选票数高出了一大截。

瑞典极右翼的崛起，正是因为他们鲜明的反移民立场。

即使是其他原本的主流政党，为了争取民意，也在相应地调整政策。

风往哪里吹，哪里才是潮水的方向，已经再明显不过。

全世界都在右转，各个国家都有民族主义情绪的高涨。

美国的特朗普就被视为极右翼的典型。

而在欧洲，从法国到意大利，从匈牙利到斯洛文尼亚，这些激进、极端、保守、排外、反多元文化、反全球化、煽动民粹和仇恨的政党，一个接着一个冒了出来。

特朗普好歹还是共和党内部的基因突变，但欧洲的极右政党，很多都和纳粹有着千丝万缕的联系。

过去这些极右翼政党是没有什么存在感的边缘角色，但这几年他们的支持度不断升高，开始有了越来越广泛的群众基础。

所谓的民主其实就是数字游戏，谁拿的选票多，谁就能上台，大家都要遵守这个规则。

为了获得更主流民意的支持，在选举中拿到更多的选票，极右翼政党有时也会主动减少过于偏激的言论，但他们的民粹保守本质不会改变。

在许多欧洲国家，现在大概都有20%上下的选民支持极右政党，瑞典只不过是最新的一个。

而且让人不安的是，这部分人数还在继续增长。

瑞典大选结果公布之后，法国极右翼政党国民阵线的领袖玛丽·勒庞特地打电话给伊米·奥克松，祝贺他的同时也在庆祝极右翼的势力范围又扩大了一些。

BBC做的这张图标明了欧洲各国最近一次选举里民粹政党的得票率——

芬兰18%、丹麦21%、德国12.6%、奥地利26%、匈牙利19%、荷兰13%、瑞士29%、意大利17.4%……

不知道几年之后，下一次选举，这些数字又会有怎样的变化？

此时此刻的我们，大概正处在一个深刻变化的临界点上。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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