范冰冰生日仅3人祝福：你只有站在暗处，才能看清楚人心

作者 | 馆长  来源 | 每晚一卷书（ID：JYXZ89896)

首先说明，我不是为范冰冰洗白，也无意评价她的作为，法律才是她的最终归宿。 

写这篇文章，是看到了一些人一些事，从心底迸发出来的感慨。 

范冰冰消失100天了，曾经闪闪发光无比高调的女明星在一夜之间偃旗息鼓，仿佛人间蒸发了一般。 

最近两天，再次听到她的消息，因为一则“范冰冰37岁生日，整个娱乐圈只有三个人送上了祝福”的新闻。 

16日零点刚过，还惦记着范冰冰、给她第一时间送上生日祝福的，只有寥寥三位。 

第一位是李玉，她发微博祝范冰冰生日快乐，并附上了一张自己跟范冰冰的工作照。 

李玉导演曾跟范冰冰合作《苹果》、《二次曝光》、《观音山》、《万物生长》，可以说是范冰冰演员路上最重要的人之一。 

第二位是杨天真。她是范冰冰的前经纪人，据说后来成了鹿晗的经纪人，接着又合作了张艺兴，如今在圈中地位不容小觑，可以说她与范冰冰互相成就了彼此。 

她说：“没有你，我不会成为今天的我”。 

第三位是刘维，其实从他的微博来看，她和范冰冰平日里的互动并不多，名气也远不及她，若换成以往，发这样的微博，一定会被说成蹭热度，抱大腿，但在如今人人都避之不及的时候却能送上生日祝福，他的理由很简单，不过是“点滴记心间”。 

对比今年的冷冷清清，去年今日的范冰冰可谓春风得意，风头无两。 

上一个生日，她一手捧着影后的奖杯，一手戴着李晨求婚的钻戒，是事业爱情双丰收的人生赢家，朋友们纷纷祝贺。 

媒体用“三喜临门”来形容那一天的范冰冰。 

范冰冰也幸福发文，称自己觉得：“人生完美了！” 

而这个生日，她便从大家眼前消失了，与她一同消失的还有那些看似热闹的人际关系。 

去年此时，在范冰冰的微博下面，明星们扎堆儿送祝福，吉祥话儿说不完。 

何炅、舒淇、郭敬明、杨颖、张靓颖、陈汉典。 

蔡国庆、吴昕、林心如、张译、高云翔。 

吉克隽逸、张庭、张钧甯、霍思燕、陈学冬。 

以上仅是部分前排发祝福的明星，足见当时“盛况”。 

而今年呢，风口浪尖上，范冰冰的两位至亲之人：未婚夫李晨和弟弟范丞丞，均在社交媒体上沉默了。 

娱乐圈，向来是个跟红顶白、一沉百踩的所在。仅仅一年的时间，范冰冰就从聚光灯的中心走到了人生的暗处。 

如今的范冰冰，可谓生动演绎了什么叫“树倒猢狲散”。 

人生真的是变换莫测。 

所以，作为路人，看到如此落差，还是挺感慨的，明星的生活不过是夸张放大版的普通人生活罢了，谁又能保证，自己跌落谷底的时候，会有人惦记呢。 

都说锦上添花易，雪中送炭难。 

人呐，只得站在暗处，才能看清楚人心。 

贫在闹市无人问，富在山中有远亲，你好的时候，处处都是朋友，你落难的时候，可能身后空无一人。 

你以为那些所谓的朋友像堵墙，能在你每一次孤立无援的时候让你依靠，其实他们只是一堆沙，随风就散。 

《晓说》是高晓松主持的家喻户晓的栏目，但很少有人知道，“晓说”这个名字，是韩寒帮忙取的。 

其实早年间，高晓松与韩寒之间还有场骂战，但正所谓“英雄不打不相识”，经过那场风波后，他们成了朋友。 

2011年，高晓松因为酒驾入狱，而此时正值他执导的电影要上映，他行动受限，无法出席上海的首映礼。 

他在狱中给朋友们一个一个打电话，拜托他们帮忙站台宣传。 

有的朋友满口答应，但在首映当天却踪影全无。 

而韩寒顶着刚比赛完的疲惫，连夜从山东赶到上海参加典礼，鞋都没有换就上台帮高晓松宣传。

高晓松每次谈及此事都特别感动：“落难的时候有人帮你，这是锦上添花的时候完全不能比拟的，这件事我一直放在心里。” 

患难识人，泥泞识马。当你得意时，你的朋友知道你是谁，当你失意时，你知道谁是你的朋友。 

其实，人性本就是如此，趋利避害是本能， 所以当你落难时，别人离你远远的，别怪世道残酷，因为他们也没错。 

只是，这个时候如果有人愿意帮你，那真的很了不起。 

范冰冰摊上事儿之后，曾经因为抱得女神大秀恩爱的大黑牛李晨，就彻底沉默了。 

2015年，范冰冰发布微博“我们”，正式宣布和李晨在一起，到如今李晨已经陪她过了3个生日，每一个生日都是一个惊喜。 

从粉红少女派对到高定陶瓷娃娃，范冰冰每一次发布与李晨的微博都是一个大型秀恩爱现场，甜了一波又一波的单身狗们。 

范冰冰的事，法律自会裁决。

可如今她身处低谷，也一定在内心渴望得到来自另一半的安慰和鼓励吧。 

最凉不过人心，风光无限时，你是我捧在手心里的公主，风光不在时，便避之不及。 

前些天有个帖子讨论得特别火：28岁的丈夫被查出肝癌晚期，他的妻子得知这个消息后，做的第一件事，是打掉了腹中五个月的孩子，并且提出离婚。 

据说，两家的经济状况都很好，门当户对。 

男方的父母苦求儿媳留下孩子，提出赠予上海的房产以及两百万现金，并且不需要女方抚养孩子，也不会耽误女方再嫁，但女方还是执意打掉了孩子。

帖子发出后，网友议论纷纷，有人认为，面临生老病死，唯有真情能经历考验，妻子这样做过于狠心： 

也有网友认为，不能对女方进行道德绑架，一来癌症有遗传基因，二来女人生孩子并非易事： 

看完新闻和网友的评论，心情十分复杂。其实不能指责女方什么，毕竟怎么做都是她自己的权利。

只是未免还是觉得太过薄情。 

其实从医学角度来看，肝癌是没有遗传家族史的，母亲得癌症有可能通过子宫将癌细胞扩散给孩子，但是父亲理论上并不会遗传或传染下一代。 

我想，对女方来说，大概这个男人也许只是她一个合适的结婚对象，这个婚姻和孩子只是她到了一定年龄顺理成章的产物。 

所以当生活遭遇坎坷的时候，她可以冷静清醒的抽身离开。 

她不是没有选择，她只是选择了做一个精致的利己主义者。 

人啊，失意了，才知道谁的手最暖，落魄了，才明白谁的心最真。 

这段时间，黄光裕要出狱的消息又传的沸沸扬扬。 

黄光裕是谁？ 

他是一手创立国美的商界枭雄，却在十年前，因商业违规被警方带走，2年后，再被判有期徒刑14年（后三次减刑），并处罚金6亿元，没收个人财产2亿元。 

但令人惊奇的是，即便是在狱中，黄光裕仍然登上了胡润富豪榜第38位。 

这一切，都离不开黄光裕的妻子：杜鹃。 

杜鹃

2008年，黄光裕带领下的的国美撞上了突如其来的冰山，黄光裕入狱后，国美一度群龙无首，老臣反目，众叛亲离，国美摇摇欲坠。 

这个时候，杜鹃站出来了，她没有嫌弃自己的丈夫身为阶下囚，而是选择站在风口浪尖上，力挽狂澜，代夫出山。 

她说：“没事老公，你出狱时，我给你一个更好的国美” 

她一改以前的柔弱模样，剪掉长发，以泼辣干练之势帮助老公守住江山。 

十年，她帮国美从亏损8亿做到如今的估值几百亿。 

以致于黄光裕在狱中感激地说，“国美有你在，我放心。” 

人这辈子，身边的人来来往往，但也只有跌倒了，才会知道谁真心待你。

有的人选择独善其身，有的人却能不离不弃，甚至成为你跌倒后的一根拐杖，给你强有力的支撑。 

什么感情才最值得珍惜？

大概就是，你人生得意时，我貌美如花，更能锦上添花。 

你跌落谷底，我洗尽铅华，也能雪中送炭。 

我不想为范冰冰洗白，如今她门庭冷落，自有前因。 

眼见她起高楼，眼见她宴宾客，眼见她楼塌了。 

只是从花团锦簇到人走茶凉，人心凉薄，未免令人唏嘘。 

我只想说： 

朋友，不是你得意时的弹冠相庆，而是你失意时的守望相助。 

爱情，不是你顺遂时的你侬我侬，而是你落魄时的不离不弃。 

人，只有站在暗处的时候，才能看清一个人，才能看清楚世道人心。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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