刘强东酒局沉浮录：从结识章泽天到曝出性丑闻，成也夜宴败也夜宴

一场夜宴，刘强东结识了奶茶，自此“不知妻美”；一场夜宴，刘强东涉嫌性侵女生，从此走上不归路。成败皆夜宴。强人治理模式下的京东正遭遇一场生死劫。

作者 | 杨凯

来源 | 市界资本圈

刘强东这个中秋过得并不安生。

这一天，路透社一篇报道再次将这位京东CEO推向风口浪尖。文章披露的是关于刘强东性侵事件的大量细节：他一上车就摸受害女生；他强迫与女生发生性关系；女生保留了他性侵的“证据床单”，说“如果只有我自己，我会自杀，但是我还有父母”。

报道推出后，刘强东律师和京东发言人迅速作出回应：刘强东坚信他是无辜的，并且已经全力配备调查；有关信息并不是事情的全部真相。不过，京东股价依然遭遇重挫，暴跌7.47%。

这一切始于二十几天前那场夜宴。8月30日，刘强东在美国明尼阿波利斯的日本料理餐厅Origami Uptown操办了一场买单价为2200美元的饭局。觥筹交错后，刘强东被曝涉嫌性侵。

这场饭局的代价，此后逐渐加码，远超买单价：8月30日事发至今，京东市值缩水约合638亿元人民币，刘强东身家随之缩水约99亿，堪称史上最贵夜宴。

颇具意味的是，中秋节后，刘强东夫人章泽天在朋友圈发声：“只要一家人在一起，便是圆满。祝愿中秋快乐！惟愿守得云开见月明。”而刘强东与章泽天的相识，也是始于一场饭局。

久混夜宴，迟早要还。一场夜宴，刘强东结识了奶茶，自此“不知妻美”；一场夜宴，刘强东涉嫌性侵女生，从此走上不归路，强人治理模式下的京东也遭遇一场生死劫。成败皆夜宴，刘强东和他的京东，还能守得云开见月明吗？

01

纵横江湖多年，刘强东历经饭局无数。但8月30日的那场饭局足以令他铭记一生。

“618”一役结束后，京东进入了淡季。按照往年惯例，熬过了那段没日没夜的战斗期，刘强东会外出散散心。恰巧明尼苏达州立大学和清华大学经济管理学院合办的DBA项目即将结业，刘强东便将目的地定在了明尼苏达，散心之余顺便领取“颇具含金量”的毕业证书。

8月27日，刘强东携一家老小乘坐自己那架颇为拉风的湾流G650降落在了MSP机场。热情的留学生们租来一辆奔驰高顶商务车接机，旅途劳顿的刘强东一行在大家的簇拥下早早回到酒店休息。

生怕怠慢了“金主”的校方为刘强东“私人定制”了一周的日程。白天的课程上，教室第一排的最佳位置专属于刘强东。作为全场焦点，刘强东忍不住上台秀了一把他的“宿迁味儿”英语，分享他对新零售的见解以及与老伙计沃尔玛联手拓展全球业务的设想。台下，掌声如雷。

慵懒的时光总是过得很快。结束第三天的忙碌行程后，一身疲惫的章泽天先行回到酒店休息。刘强东则在朋友的陪同下来到了当地颇为有名的Origami Uptown餐厅。“憋”了几天的他刚好也想借此机会解解酒瘾。管理学院的崔副教授倒是颇为善解人意，把那个腼腆的留学生女孩儿叫了过来，就坐在刘强东的旁边。

这天的晚宴，准备相当充分，“陪酒们”从后备箱里抱出了16瓶白酒，恰是刘强东最爱的洋河蓝色经典。豪爽的刘强东这回终于可以敞开了喝。考虑有4个女孩儿，他们又特意点了红酒、啤酒和清酒，前前后后加起来共计32瓶。一整晚，女孩儿都默默坐在刘强东旁边，不怎么说话，只是被敬酒、劝酒时才勉强喝上两杯，最后还是喝醉了。

9时30分左右，宴会结束，20来个陪酒的已经喝得颠三倒四。“久经沙场”的刘强东主动提出，送喝醉的女孩儿回寓所。“酒为色媒，色为酒媒。”此后，能够强势掌控京东的霸道总裁刘强东，却未能在酒局后掌控住自己的下半身。

▲ 电影《夜宴》剧照，图文无关

次日晚间11时许，警察进入明大刘强东所在的自习室，以涉嫌强奸将看起来神情恍惚的刘强东抓获，直至次日下午四点刘强东才被保释。美国明尼苏达州监狱信息显示，当地时间8月31日，明尼苏达州明尼阿波利斯市警方逮捕了一名性侵嫌犯，名为 Qiang Dong, Liu，出生日期为1973年3月10日。这与京东董事局主席刘强东的个人信息完全吻合。

美国各知名媒体的报道席卷而来。霸道总裁穿着橙色马甲，哭丧着脸的大头照传遍整个网络。

在无尽的争议与质疑声中，刘强东低调回国，正常出席了京东的活动。如今，美国警方调查已经结束，案件正式移交检方。“强奸既遂”、“一级强奸罪”等各类消息，让刘强东苦苦经营了许久的完美人设瞬间崩塌，伴随而来的是京东股价的持续暴跌。

苦不堪言的刘强东或许本能地想闷两口老酒。但此时此刻，他恐怕只能默默咽下心中的那一杯苦酒。接下来的日子，他只能如微博签名那样，“低调、低调、再低调”了。

02

有江湖的地方，就有酒局，有酒局的地方，就难免是非。

这不是刘强东第一次因为夜宴而卷入性侵丑闻。上一次是2015年圣诞节的次日，就在他与章泽天举行婚礼的那所豪宅里。

不得不说，章泽天带给刘强东的改变是颠覆性的。认识章泽天之前，尽管刘强东生意做得不错，也时常去美国进修，但却始终无法摘掉“乡镇企业家”的帽子。衣品糟糕、高挺着啤酒肚的刘强东无论做什么都会让人觉得有股“土味儿”。

2013年，在一场饭局上，刘强东与章泽天“瞬间电光火石”，陷入热恋。也是在那个秋天，刘强东终于决意与过去那个憨厚直率、不修边幅的“乡镇企业家”告别。爱情的魔力赐予他无尽的动力，他开始跑步健身、控制饮食，蓝莓配酸奶成为他的标配晚餐持续至今。留学的4个月时间，他整整瘦了36斤。自然，作为身材杀手的各类酒水也成为他的抗争对象。虽然做不到完全戒掉，但至少节制了许多。

重组家庭后，刘强东会花更多时间陪伴家人，逐渐找到了工作与家庭的平衡点。“过去的话，有时间都是喝酒、钓鱼、穿越沙漠、去西藏、去新疆。现在有家庭有小孩，就把过去的这些时间回归家庭了。”不过，他也会时常怀念过去随时出去与兄弟们拼酒的日子。一旦有机会，“耐不住寂寞”的刘强东还是忍不住“组局”。

2015年10月，刘强东与章泽天在澳洲顺利完婚。为了这场万众瞩目的婚礼，刘强东豪掷1600万澳元（约合人民币8033万元）购入三层顶层豪华公寓。从这座宛若宫殿的豪宅，可以俯瞰悉尼港全景。

而也正是在这所豪宅，刘强东卷入了另一起性侵丑闻。这年12月26日，刘强东与妻子在这所豪宅里举办了一场私人party。

正是这场名流荟萃的私人夜宴，给了一个叫徐龙伟的富豪以可趁之机——此次强哥的夜宴上，酒同样是重头戏，一位女子因此喝醉了；夜宴结束，徐龙伟将喝醉的女孩带到香格里拉酒店图谋不轨。事后，徐龙伟被裁定包括猥亵、袭击、在明知对方不同意的情况下强行发生性行为在内的七项罪名成立。

澳洲夜宴丑闻曝光后，刘强东以“可能让他的婚姻和生意受损害”为由，向法庭申请禁止令，防止自己的名字出现在庭审中，以保护身份不被公开。随后，京东方面甚至要求禁用“亿万富翁”和“顶层公寓”等措辞。最终，这一请求被拒绝。

庭审中，刘强东虽未受到任何指控，但其名字还是与案子扯上了关系。京东发言人强调，“正如法官明确指出的那样，刘先生与此案没有任何牵连，他整个晚上都在为客人准备食品，晚餐的大部分时间都不在餐桌上。此外，罪犯是一个偶然认识的人，罪行是当天晚些时候在另一个地点发生的。”

但此事还是在国内媒体的渲染下引起了极大关注，对刘强东和京东的声誉造成了不小冲击。特别是在Me Too运动中，此事被扒了出来，经多方炒作，不少人都误以为刘强东就是性侵的主角。

经此种种，刘强东依旧确信自己一直没有变，创业初心不改。他想不通，自己为什么总被“针对”。但他确实变了，尤其京东上市后，奢靡的生活早让他把当初“从创业那天起，我就从来没有准备重新穿上皮鞋”等誓言抛之脑后了。

或许正如罗永浩所说:“做企业你得全程不舒服。如果老板觉得舒服了，那就是企业危险的开始。”没错，刘强东一舒服，京东的危险就开始了。

03

酒，于刘强东乃至整个京东来说，似乎成了一剂致命的毒药。殊不知，酒也曾是刘强东的幸运符，曾助力京东一路逆袭，杀出重围。

时间拉回到26年前。彼时的刘强东还是一个刚从酒乡走出来的乡土少年。

刘强东是从苏北宿迁来龙镇长安村一步步走出来的。“项羽故里”和“白酒之都”是这座贫困小城的双重标签。拥有洋河与双沟两大名酒的宿迁酒文化颇为兴盛，“麻雀也能喝二两”的俗语就是宿迁人酒量的真实写照。生长在这片土地的刘强东天生能喝酒也爱喝酒。

▲江苏宿迁

“酒这东西看起来是一碗水，实际上却是五谷的精灵。”由粮食变成酒的过程，经过了数不清的历练以及粉身碎骨的痛苦。或许，正是酒赋予了刘强东与生俱来的创业态度与冒险精神。这所小城给予刘强东的馈赠除了酒量之外，还有那股朴实劲儿和实干精神，这些都是他创业路上的宝贵精神财富。或许，正是感念于故乡的馈赠，创业成功后，刘强东带领老家的村民种植有机水稻、建立物流中心解决就业问题，对宿迁人民几乎有求必应。

1992年，刘强东揣着仅有的500块钱，坐火车一路北上。此时的他还没从考了宿迁第一名后家里请人在村上放了三天电影的激动心情里走出来，大都市的一切都令他兴奋不已。原本一心从政的刘强东很快就被这个自己曾无数次幻想过的首都给“教育”了。他发现，在这里生存才是第一要务，500块钱活不了多久。

这难不倒从小就会帮家里讨生活的刘强东。大一时，他便通过做家教、抄信封养活自己，没再问家里要过一分钱。后来，他通过自学编程赚了不少钱，为了赶时髦还专门买了一部摩托罗拉的大哥大，令身边的同学羡慕不已。此后，一心赚钱的刘强东开过饭店，也去过类似传销的一家外企工作还债，折腾了一圈依旧一穷二白。

1998年，考察了两个月的刘强东终于下定决心用自己仅有的12000块钱二次创业。他在中关村盘下了3.2平方米的摊位，卖刻录机和光盘，并注册了京东的前身“北京京东世纪商贸有限公司”。这一年，李国庆已经创立了当当网的前身北京科文国略信息技术公司和课文剑桥图书公司；张朝阳已经利用风险投资创立了搜狐公司的前身爱特信公司；马云也加入了中国对外经贸部，负责开发官方站及中国产品网上交易市场。而20出头的刘强东还只是个没见过什么世面的毛头小子。

不过，能喝酒又坚持“正品行货”的刘强东很快就打开了销路。到2001年，3年时间里，他靠卖刻录机和光盘赚了1200万。一家小小的柜台很快发展到12家连锁店，他也成了全国最大的经销商。

如果不是因为非典，刘强东可能会坚持他的实体连锁生意。非典到来之后，刘强东被迫走进B2C电商领域。“一切都是偶然”，他说。

也正是这个偶然，成就了后来的京东。2004年，以3C为切口的京东正式上线。而京东后来的对手们此时早已风光无限，李国庆引入老虎基金，现金流充足，攻城略地一往无前；马云在B2B确立领先地位后，决意杀入C2C市场，创建淘宝网，挑战eBay易趣；亚马逊以7500万美元收购卓越，杀入中国市场；当当建立了自己的配送网络，如鱼得水；黄光裕因为国美上市成为中国首富。

此时的电商江湖一片混战，但混乱意味也着无限的可能性，关键在于如何在混乱中成为时代的掌控者。刘强东显然做到了。此时的京东是一匹不起眼的黑马，不断冲破强大对手的重重围剿与自身发展的枷锁。新蛋、易迅、亚马逊中国、易趣、当当这些曾经声名显赫的巨头一个个被京东逆袭。曾经在电商江湖混战的老玩家如今只剩下了京东与阿里，以及新加入的拼多多。

如同沃伦巴菲特一样，刘强东不停推动着自己的小雪球，从宿迁农村推到中关村，从实体卖场推到电商江湖，雪球越滚越大，很快又从北京推到纽约纳斯达克。他一直奋力向前，他的眼里是整个白雪皑皑的世界。

决心创业的刘强东时刻面对着巨大的压力。为了释放压力，他常常一个人开着越野车到沙漠上疾驰。他一路冲向沙漠尽头，两杯酒下肚，日出的景色令微醺的刘强东豁然开朗，“穿过沙漠，你也许会见到最壮丽的朝阳。”

沙漠里只能看到沙子和天空，纯净，纯粹，没有多余的颜色，也没有任何噪音和干扰。刘强东喜欢在那里思考。“在北京这种大都市里，你是很难思考的。”可如今，刘强东已经丧失了穿越沙漠的兴趣亦或是勇气。

这或许预示着当初的创业激情正在逐渐褪去。不知道他是否还记得曾经那些关于财富、关于荣耀、关于改变世界的冒险的种种梦想；亦或是真的安于现状到忘却了如何思考。

04

如同《红高粱》里那样，中国人自古就有对酒神的原始崇拜。人们会不自觉地把酒量和勇气、豪爽、冒险精神联系在一起。而京东正如武侠小说里的桥段，你会觉得在这里就该大碗喝酒、大口吃肉，豪气干云就是京东的底色。

创业初期，京东的渠道资源匮乏，以营销见长的刘强东会带着一帮兄弟跟客户拼酒。可以说，京东最初的客户都是靠着拼酒一个一个拼出来的，以至于“酒文化”最终根植在京东的血液之中，成为京东的永恒烙印。

商业故事里哪有什么真正的创业秘籍，都是荒野求生而已。而京东的故事里，他们就是靠拼酒杀出了一条血路。“哪怕只有一杯啤酒的量也得敢端起白酒”，这就是京东的创业精神。创业初期，京东的员工们会定期聚会，几杯酒下肚，工作中积累的疲劳和郁结化解大半。白天还耿耿于怀的工作矛盾，很快在酒桌上被发泄出来，随着酒气消于无形。酒桌上，大家既会撒泼打诨，也会探讨业务上的得失与心得体会。酒酣耳热间，很多不起眼的小漏洞被及时发现并解决，很多销售目标被拍着胸脯立下。酒醒后，大家继续满血拼杀，而京东也在这样的节奏中突飞猛进。

对于靠销售起家的京东而言，酒量是一项重要的业务能力。以至于刘强东那句“你连喝酒都干不了，还能干什么呢？”流传至今。京东尚属于弱势渠道的时候，很多高管都曾为了工作频繁应酬，喝醉是常有的事。京东原副总裁兼IT数码事业部总经理杜爽曾因跟供应商喝酒导致颅内高压，眼球毛细血管破裂；集团副总裁王笑松酒量不好，但和代理商吃饭时常常毫无保留，喝到吐为止，第二天还照常上班。

京东的酒文化，第一是敢不敢的问题，哪怕只有一杯啤酒的量也得有胆量端起白酒和人拼。京东的人必须有血性，不顾及后果，先实现目的，再处理后续问题；第二是说不说的问题，得清晰表达自己的想法，也得把别人的想法听进去。酒文化的精髓在于沟通，工作上的冲突和摩擦，喝酒的时候你走我两个，我捶你两下，就过去了。

京东的钢铁执行力同样与喝酒有关。在京东的内部聚会或庆功宴上，刘强东往往喝得最多，一个一个敬酒，但不管喝到多晚，喝了多少，第二天早晨，他必然准时出现在公司开早会。刘强东的身体力行、严格自我要求造就了京东自上而下的强大执行力。

团队逐渐壮大之后，不同部门之间的协调沟通成了大问题。刘强东又把“酒文化”发展为京东内部的凝聚剂。刘强东常常会绕过中高层领导，直接和基层员工在酒桌上互诉衷肠，畅所欲言。刘强东对管理层有天生的警觉心，还专门建立了严格的反腐机制。但农民出身的刘强东对于基层员工却有一种天然的亲切感，他喜欢大家叫他“东哥”，因为这样更亲近一些。他知道支撑这家公司的是基层，“只要基层不乱，无论管理层如何调整，都不会动摇公司的根基。”

每到一个地方，刘强东都会找基层的员工一起喝酒，借此了解员工的福利待遇、制度、装备和对于工作的想法，“对于公司毛细血管的东西，我可以不管，但我要知道。”事实上，他往往是会管的，他会当场要求提升基层员工的福利；给基层员工装空调；给员工上社保；让兄弟们能在县城买上房子。员工们抱怨内部沟通与跨部门协调困难，刘强东就花7、8个月时间给几万名员工做一次全方位考核，把缺乏协调能力的中高层管理人员淘汰掉。虽然做不到有求必应，但他已然做到了一个老板力所能及的全部。

京东很快从一家小公司发展成为拥有几万员工的上市公司，刘强东知道不能再像草莽创业时期那样随性而为。他凭借酒文化将公司粘合起来，令组织严丝合缝，制度顺畅有序。京东早期那种兄弟齐心的创业激情没有被稀释，对顾客需求的迅速反应也没有丢。“我要求自己和我的团队始终保持一家创业企业的状态：对市场变化要有最高的敏感度，仍然像早年的京东那样具备快速和强大的执行力。”

实干与执行是京东的立身之本。公司壮大后，刘强东常常思考如何创造兄弟齐心的文化氛围、保持创业创新的激情，而“酒文化”就是他想出的对策。一路逆袭的京东从来不怕竞争对手。“我的恐惧只来源于内部团队，恐惧我们内部团队会管理不好，比如说企业文化断层，企业文化崩溃，价值观信仰缺失。”

从管理角度看，京东“酒文化”的成功是必然的，刘强东所倡导的管理信条与柳井正的《一胜九败》如出一辙，“要强调速度干劲，革新执行力；要保证公司效益最大化，全员齐心协力；要打造各部门联动的机制；要独立自主，不要落入任何企业麾下；要让全员认同公司的目标目的和构想。”

刘强东拜访法国拉菲古堡 （图源：搜狐）

有趣的是，酒业在推崇酒文化的京东同样有着举足轻重的地位。2015年起，京东不仅成为国内名酒茅台、五粮液、洋河线上线下最大的零售商，同时也成为拉菲集团在中国大陆最大的零售商。

05

电商是个烧钱的买卖，这点刘强东最清楚不过。而上市之前，京东几乎每一笔融资、每一次重大战略调整都是在酒桌上敲定的。

2006年，扩充了数码产品品类后，京东陷入了严重的资金短缺困境，几近瘫痪。在接二连三的融资失败后，这年10月，刘强东在北京香格里拉与今日资本总裁徐新见面。抱着试试看的态度，刘强东事无巨细地向徐新介绍了京东的经营理念、模式和未来规划。几个小时后，徐新被刘强东打动，同意投资，并从200万美元加注到1000万美金。融资谈成后，刘强东才彻底松了一口气，端起面前的红酒一饮而尽。

靠这第一笔融资，京东在北京、上海、广州三地自建物流，并开始其近乎疯狂的价格战，“价格屠夫”的称号也由此而来。

2008年的金融危机引发资本寒冬。许多谈好的投资都临时反悔，又是徐新站出来注资800万美元力挺京东，加上梁伯韬以及雄牛资本等共计2100万美元的注资，京东才得以渡过难关。这才有了后来与国美、苏宁的价格战、品类不断扩张、切入电商平台，物流、市场和研发，这京东的三叉戟也慢慢确立起来。

刘强东在央视《对话》栏目中说过，京东迄今为止最大的一笔融资完全是靠喝酒喝出来的。当时，刘强东正在新疆巡访，俄罗斯投资集团DST创始人Yuri Milner提出要和他一起看看京东的聚会。那天的聚会和往常没什么不同，刘强东与新疆的兄弟们聊着家常话，喝得很开心。喝到后来断片儿了，刘强东连如何和投资人告别的都记不起来了。但京东就这样顺利拿到了DST 5亿美金的投资。Yuri Milner给出的理由很简单：通过这场宴会，他确信刘强东是一个善待员工的企业家，值得信任。

谈到京东的融资，有一个人绝对绕不开，那就是高瓴资本的张磊。张磊不仅是京东的重要投资人，还直接促成了京东与腾讯的合作。

2011年，张磊便有意撮合两家的合作，但腾讯依旧在自有电商平台打造上下了重注；处于快速扩张期的京东也不愿向大佬低头。执着的张磊最终依靠“移动”和“库存”这两个腾讯和京东各自的关键词说服了双方。

谈判陷入僵持后，张磊组了个饭局。推杯换盏之间，双方仅仅用了两个小时就敲定了这起互联网史上最大交易案的全部细节。最终，京东收购腾讯B2C平台QQ网购和C2C平台拍拍网以及易迅网部分股权；腾讯向京东开放微信和QQ流量入口，并成为京东第一大股东，腾讯总裁刘炽平进入京东董事会。

尽管这次重组让京东如愿赴美上市，也促使其当年的销售额达到1120亿元，超越苏宁，成为第一大零售商。尽管刘强东在发布会上豪言：“终有一天，中国最大的互联网企业是京东，中国最大的民营企业是京东！”但不服输的京东终究低下了头，投靠了腾讯。

京东一路逆袭而来，每年都有新的危机和新的对手。它跟互联网公司打，跟传统零售打，也跟自己打，虽然从没有摧枯拉朽、酣畅淋漓的胜利，从不肯服输的京东却也磕磕绊绊地赢了新蛋、当当等诸多对手。然而，投靠腾讯后，以前的努力都付诸东流。加入腾讯系看似是逐梦，实则却是刘强东亲手将过去的梦想埋葬。

2017年的乌镇互联网大会上，刘强东首次活跃在饭局之上。先是在丁磊的猪肉局上露了个面，10分钟后刘强东便与王兴一同出现在“东兴局”上。马化腾自然是“东兴局”的绝对主角，刘强东与王兴伴之两侧。好酒的刘强东与爱劝酒的马化腾倒也合拍，喝了个痛快。然而，杯子碰在一起，都是梦破碎的声音。刘强东知道，入了这个局，他便再也唱不了主角了。

东兴局

当然，刘强东的“牺牲”也是有回报的。2017年，京东一路高歌猛进，眼看要赶上“掉队”的百度，晋升互联网新三巨头之列。在刘强东的眼中，他不是腾讯对抗阿里的棋子，而是与马云、马化腾比肩而立的对手。

在2017年底出版的《品质经济》的序言中，刘强东很是得意地写道：“在过去的13年里，京东的年均复合增长率超过150%，交易额增长了9万倍。在过去的12个月里，京东的GMV（销售额）超过了万亿元。在2017年《财富》世界500强中京东排名第261位，比上一年前进了105位。”

可是2018年的剧情并没有按照刘强东预想的那样发展，京东彻底掉队了。京东觊觎许久的下沉市场被拼多多所蚕食，不仅与阿里的差距被进一步拉大，估值也被TMD全面反超。如今，更晚出道的王兴也如愿敲钟，身价倍增。

资本市场对京东并不友好，其市值从上个季度654亿美元的高点，跌至350亿美元，几近腰斩；曾经的盟友高瓴资本也在短短几个月时间减持京东6亿美元，转而投向阿里的怀抱。京东彻底失去了资本的青睐。

而8月底的这场疑似性侵纠纷无疑是雪上加霜。短短二十几天，京东市值缩水约合638亿元人民币，刘强东身家随之缩水约99亿元。

刘强东无论如何也想不到曾经春风得意、帮助京东一路疾驰的酒桌如今却成了一场噩梦。几经沉浮，酒桌成就了京东，却也险些毁掉京东。

“打江山易，守江山难”。创业的激情终究无法成为一个企业的永动机，办公室里挂的“静思勤忍”也终究只是四个字而已。对于刘强东而言，眼下该考虑的恐怕不是如何进攻，而是如何防守了。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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