文 | 难得君
她是一个出生于1996年的女孩儿，加拿大籍华人。
甜美可人，自信大方。
她就读于不列颠哥伦比亚大学政治系。这所位于温哥华的加拿大一流高等学府，常年在各种全世界大学排名中处于20到30位的区间。和清华、北大一个量级。
她品学兼优，兴趣广泛，擅长音乐、绘画、设计，立志作一名“利用司法制度去维护公平公正”的律师。
她的爸爸是一名颇有实力的地产商，除了在温哥华拥有豪宅之外，还盘下了一个建有机场的私人岛屿。
∆程颂莲
这样一个女孩儿，你会怎样评价她？
别人家的姑娘？投胎技术性人才？人生赢家？
如果我告诉你，她叫程颂莲，真实身份是被开除党籍的落马贪官、原河北省委书记程维高的孙女，中国“红通”名单里和赖昌星一个数量级的外逃贪腐分子程慕阳的女儿，你做何感想？
你会竖起中指，你会吐出国骂……
是的，这些国家蛀虫，卷走了亿万财产，拿着你我他、无数中国人的血汗钱走入西方上层社会漂白镀金，简直是可忍，孰不可忍！
程氏父女的故事，你一定想听。反腐，和每个国人都有关！
01
顶级巨贪变身地产大亨
2000年8月，程慕阳在父亲、当时还是河北省省委书记、省人大常委会主任程维高的安排下，经香港仓皇逃往加拿大。
仓皇这个词，在此处主要用来形容时间紧迫。其实，程慕阳程衙内心里多半是美滋滋的，转移了数额庞大到刷新三观的资产到国外，崭新的生活正在等待自己。
∆程维高
就像《人民的名义》里，丁义珍成功外逃，在飞机上要喝香槟酒，对着空姐用英语说：“干杯，为了自由！”
一个人，真的可以厚颜无耻到这个地步。
程衙内到底卷走了多少钱？我当然不知道确数，但一定是数以亿计。
这位1969年出生于江苏的官二代，年轻的时候相貌英俊，温文尔雅。他曾在10年间，仗着自己父亲的权势，在国内外创办了32家公司，总资产达数亿人民币。
∆1992年11月，大学毕业仅一年多的程慕阳（左三）频频出席北京的政商和媒体圈聚会。图片来源：凤凰周刊
1995年，他成立了一家地产公司，在父亲的批准下，由河北省财政厅一次性打款3700万元到他个人的香港账户上，美其名曰：投资。
∆1992年11月2日，23岁的程慕阳与友人在宴会后合影。图片来源：凤凰周刊
从这两个案例就足以窥见他的疯狂。
没人举报吗？没人发牢骚吗？有。
1996年，一个深知程家内幕的人喝大了，在酒席间说：“程慕阳打着老子的旗号拉广告，拉赞助，招摇撞骗，封官许愿。将来程书记出了事，可能就是毁在他儿子手里。”这句话传到程维高耳中，两个月后，这人被投入监牢，关了十年。
一个人，真的可以肆无忌惮到这个地步！
∆程维高秘书李真在法庭上
程慕阳帮助父亲秘书转移贪污得来的赃款，将这些不义之财转移到了加拿大。然而程慕阳的嚣张日子并不长，2000年，程维高秘书李真贪污受贿事发，程慕阳也牵扯其中，不久之后，程维高落马。
成功逃至加拿大之后，程慕阳改头换面，更名“迈克尔·程”(Michael Ching)，做起了地产生意。
∆迈克尔·程
他注册了以自己名字命名的地产公司，开发了几个精品楼盘项目，生意做得风生水起。与很多外逃只能吃老本的贪官不同，程慕阳的资产呈良好上涨势头，变身为温哥华的成功商人！
程颂莲说：“爸爸给我树立了很好的榜样……我希望能成为像他一样有理想、有韧性的人。”
榜样？论贪婪，程慕阳的确是好榜样。二十余年如一日，把私吞公帑作为理想，劲头十足。
这个大贪巨蠹父亲的一切所作所为，都被女儿当作正常三观内的东西，全盘接受并加以欣赏了。
一个人，真可以颠倒黑白到这个地步！
他们的故事，必然会击穿底线。
02
用钱砸开政坛路
加拿大，是外逃贪官的天堂。
中加两国没有引渡条约，司法体系迥然相异、对接困难，打起官司往往迁延数年甚至十数年，因而，无数贪腐分子对加拿大趋之若鹜，温哥华的华人群体往往被视之为贪官群。
∆程慕阳的豪宅，位于温哥华西区的橡树岭社区
赖昌星在温哥华混了12年，才被遣返回国。程慕阳有加拿大永久居民身份，比赖昌星更难对付。
即使如此，程慕阳仍不放心，他想把“被遣送”的可能性完全消除。
他有一个天才般的计划：把女儿培养成加拿大政坛的显要人物，甚至竞选为加拿大总理。这样一来，他就能在枫叶之国悠哉游哉地度过余生了。
怎样为程颂莲打开从政之路？一个字：钱。
第一步，花巨资培养程颂莲。从小到大，她接受的都是加拿大的顶尖学校教育，成为同龄人中的佼佼者。
第二步，以钱为媒，不断结识加拿大高官和政治精英，再将关系网转移为程颂莲所用。
于是，不到20岁的时候，她已经成为加拿大联邦青年自由党不列颠哥伦比亚省分部主席，是一名颇有声望的年轻政治领袖。
∆程颂莲与当时还未当选加拿大总理的特鲁多
在加拿大著名私立学校约克豪斯女子中学读书时，她就认识了许多大人物，包括后来成为加拿大总理的贾斯廷·特鲁多。
∆2013年2月17日，加拿大华裔联邦国会议员陈卓愉（中）向自由党议员约翰·麦克卡勒姆夫妇介绍程慕阳及女儿。
这么风骚的操作，你想都想不到吧。
没错，廉耻限制了你的想象力。你永远不可能预计，一个无耻之徒下一步会做出什么事。
程颂莲坦承父亲对自己施加的深刻影响：“他在我很小的时候就跟我讲很多新闻，培养了我的世界观、价值观，让我对事物有了自己的看法和理解。”
程颂莲生于1996年，程慕阳在2000年逃亡。可以推断，最晚不超过逃亡的第三年，即2002年，程慕阳已经在进行他的培养计划。
真是深谋远虑。中国的外逃贪官之中，可能没有谁有程慕阳这样的前瞻性眼光。
这样的蛀虫，每多一条，都是国家的大不幸！
03
垂死挣扎还是安然度过？
如果中国在2014年没有展开全球通缉外逃贪腐分子的“猎狐行动”，或者“红色通缉令”里没有程慕阳的名字，那么程氏父女的计划会继续顺风顺水地推进下去。
在加拿大、在温哥华，程慕阳已经成为风云人物。因为地产生意做得大，他获得过英女皇钻禧勋章。
∆程慕阳在加拿大从事房地产开发，生意做得很大，而且曾获得过英女皇钻禧勋章
程颂莲在大学里已经读到大三，很快便能完成学业，真正投身政坛。
∆2014年8月程颂莲与国会议员Marc Garneau
“红通”名单把他们的清秋大梦，击得粉碎！
程慕阳真实身份暴露，他在温哥华已混不下去了。
青年自由党紧急开会，撤销了程颂莲的职务。
政坛梦遭遇重挫。父女二人忽然消失了！完全没了音讯！
可是，早在“红通”名单发布之前，程慕阳忽然以女儿的名义，将100万美元打入一家在纳斯达克上市的企业账户，并洽谈融资事宜。
这是明目张胆地转移资产！程慕阳在国内一定有内线，依据内线的消息，他做出了将资产转移给女儿的决定。
谁也不知道，在这段时间，他是否有其他的巨额投资。他一共有三个子女，除了程颂莲被曝光之外，其他两人仍然披着神秘的外衣，程慕阳又通过他们转移了多少钱？
∆程慕阳（右）与自由党国会议员代表Andrew Leslie合影
他是在垂死挣扎？还是对渡过危机胸有成竹？
一切都要看中国能不能把他抓回来！
程慕阳在“红通名单”发布后，加紧向加拿大政府申请难民身份，但没有成功。这是2015年的事。
三年过去了，抓捕这只“老狐狸”的行动进展到哪一步？是否启动司法程序？进行到了哪一环节？
希望不久的将来，程慕阳被绳之以法！
04
“程颂莲”们有罪吗？
天网恢恢，疏而不漏。
程慕阳最终伏法，这毫无疑问。
然而，程颂莲这样的贪二代、贪三代，她和她的群体会定罪吗？定什么罪名？她已是加拿大公民，可以遣送回国吗？能够追回转移到她们名下被转移、被反复兑洗的肮脏黑钱吗？
请给我们一个答案！
每个有良知的中国人，都不能容忍贪腐横行，最盼望贪官恶贯满盈！
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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega
