凤姐将被美国驱逐，梦碎因为被深喉出卖，政治避难绿卡说谎！

来源：公众号《顾颖琼博士说天下》

八年了，凤姐的美国梦要以被美国驱逐的方式结束了。大家都还记得2010年终于被网民们骂得受不了的凤姐选择远渡美国，希望可以在大洋彼岸找到新的生活和机会。没想到，凤姐在去到美国之后反而成为了人们心目中的“励志榜样”，虽然榜样在美国只是从事搓脚等行业，但是她毕竟实现了自己的美国梦。

如今凤姐连这个梦也要破灭了，因为申请绿卡的时候说谎，她将会被美国驱逐回中国，现任美国总统特朗普已经命令移民局开始驱逐包括凤姐在内的高达一万五千名来自中国靠申请政治避难获得美国绿卡的人。

凤姐马上就要回到她梦开始的地方了！

她和其余高达一万五千名避难成员都是被一名中国深喉出卖的！

一切要从2018年9月28号美国国家公共广播电台(National Public Radio, NPR)曝光说起，超过13,500名多年前被美国政府授予庇护身份的移民（主要是中国人），面临着因为制造假申请材料被驱逐出境的境况，凤姐也在其中。

下图为NPR新闻截屏，网站采访了深喉。 根据美国国家公共广播网（NPR）的报导，深喉于2005年7月从中国来到纽约，他以为可以在美国开启新生活，“我以为我能成为百万富翁，我这个人就是比较自信”。然而落地后的第一年，他就在纽约皇后区的中国人聚集地法拉盛陷入了可悲的生活圈子，比如在门窗公司、玻璃工厂打工。

深喉取了一个英文名字叫Lawrence  【音译：洛伦茨】，深喉的意思来自于美国的水门事件，“深喉”（英语：Deep Throat），或称深喉咙，是美国历史上“水门事件”中向《华盛顿邮报》透露幕后信息的秘密线人的代号。“深喉”的真实身份一直是个谜，直到2005年美国联邦调查局前副局长马克·费尔特承认他就是“深喉”。

中国深喉在报纸上看见一个中国律师招收法律助手的工作，因为深喉在国内英文基础比较好，很轻松的就通过了面试，在律师楼做起了助理，很快他就发现，他的工作任务就是帮助那些来美国政治避难的中国人编造自己在中国遭受各种政治打击的故事，然后这些中国人会带着这些编造好的故事上庭来获取绿卡。

在我们继续谈论深喉的工作之前，我们先说一下政治避难绿卡。获得绿卡无非就以下几种主要途径：

1、亲属移民（最快，配偶子女）

2、杰出人才移民（要求较高）

3、工作移民（H-1B和L-1转绿卡，名额少）

4、投资移民（EB-5，投资或自经营美国项目）

5、政治避难移民

2017年初，凤姐在她个人公众号中发表的文章《罗玉凤：求祝福，求鼓励》中称自己已经拿到了美国绿卡。对于不少人来说，绿卡是梦寐以求的存在，所以一夜之间，凤姐似乎已经成为“草根逆袭”的榜样，行走的励志鸡汤。 而凤姐就是通过第五项政治避难绿卡获得的绿卡。

很多人会认为拿绿卡的都是名校毕业留在大公司工作的精英们，政治避难之类的非常少。其实他们不知道事实是正好相反，移民美国的中国人大部分人都是通过政治避难获得绿卡，远超读书还有投资移民的人！

下图为凤姐在美国有意参加各种政治活动，以期获得绿卡申请时候，更多的支持材料，因为参加活动的所有人都可以宣称，因为参加了这种活动，回国会被迫害。

 我们看 2016 年批准的绿卡里面，政治避难获批的绿卡，占到了批准绿卡总数的 26.8%，而工作/技术/投资移民批准的绿卡，只占总数的 19.4%。大头当然还是婚姻亲属移民，占到了 48.9%【原申请人为政治避难人员为多数】。

我曾经在拉斯维加斯中国领事馆办理的更新护照以及申请中国签证现场，看见一些拿了政治避难绿卡需要更新中国护照和虽然已经换了美国护照（先拿政治避难绿卡），但是想要中国签证回国的人被领事馆官员们要求写悔过书并被存档，承认自己申请作假，并无被迫害事实之后才能更新中国护照或者发放中国签证。

这么多人走政治避难或者难民，那这是个什么流程呢？很多人也不知道，在美国移民局官方网站上有一步一步很清晰的路线图，从第一步一直列到最后一步，总共七步，清晰明了，可操作性非常强，很多来美国的中国穷人不愿意请律师就自己在上面按照旅程做，也获得了避难绿卡。

申请美国政治避难绿卡简易流程：

1、来到美国（肉身在美国或者是肉身在美国海关入关的地方）

2、正式递交政治避难申请（进入美国一年内必须申请，申请表格免费）

3、指纹采集和犯罪背景调查（免费）

4、面试通知（人数过多，目前需要等四五年，等待时间可以用工卡工作）

5、面试（面试官询问避难原因，故事需要说服面试官）

6、移民局初审和复审，决定是否批准

7、移民局通知你最终结果（如果失败，多数人回到第五步重新开始）

附图为凤姐在移民法庭的等待的照片。时间是2012年3月14日。另外，为了确认是凤姐真身，在移民法庭也查到了她的真实姓名罗玉凤。 

深喉在为两家不同的侧重于中国政治避难申请的律师事务所工作接近五年，他的主要工作就是编造不同的避难故事，让申请者自己抄写下来然后背熟，好通过政治避难面试审批。

其中的一个律师楼，他日夜加班，一年编写了接近六百个不同的中国人避难故事，辛勤工作的他收入也很不错，甚至准备在法拉盛购买投资房。

很可惜美好都是短暂的，他一天下班路上，被FBI直接拦下叫入茶馆，FBI探员们当面告知深喉，他已经被监控了很久，现在他面前只有两种选择

要不就与同事一起入狱，要么就协助调查。

深喉毫不犹豫地选择了后者，他在接受参访的时候说“我为自己多年的作为感到沮丧，突然间有机会把一切说出，有种爆发的感觉”。

深喉向FBI提供了参与诈欺政庇申请的人员名单，查看相册识别嫌犯，上交了律师楼编写的学习指南。并且深喉身上携带针孔摄像头，拍下了所有过程。

在掌握了深喉提供的证据后， 律师事务所被突袭，联邦FBI和纽约警察联手到华埠大举查抄涉嫌在政治庇护申请上帮客户造假的多家移民律师楼。当天在曼哈顿、皇后区和布禄仑总共有21人被逮捕，26人被起诉，包括6名移民律师。至少有10家律师楼涉嫌帮华人作假。

六名律师是：46岁的刘枫凌（Feng Ling Liu），33岁的班瑞德（Vanessa Bandrich），31岁的李峰（Feng Li），53岁的肯吉雨（Ken Giles），63岁的雅各布（Freddy Jacobs），32岁的王文雄（John Wang），他们都在华人社区开律师楼。

执法人员早上9点多就到唐人街抓人，东百老汇如临大敌，从林则徐像到怡东楼整个街区被封起来，大批穿制服的执法人员涌入，多部警车停在街边，许多店家和居民到街上围观，瞪大眼睛看着FBI把一个又一个嫌犯抓走。

深喉还策反了多名利用造假材料获得绿卡的人来参与指控，其中有一个中国美女积极配合调查，是因为联邦探员告诉她，如果合作就不会被起诉，还会帮助她移民。但她最后仍收到移民局的驱逐递解信件，

她痛哭流涕的说：“是的，我确实欺骗了美国，但最后，美国政府也欺骗了我”。

深喉本人也被检方控以三项重罪，这也就意味着他很难成为美国公民了【绿卡犯罪如被判一年以上会被拒绝入籍】。深喉当时被指控最高25年监禁，但由于合作良好，最终被判六个月缓刑。

深喉目前居住于美国西南部，移民局屡次找到他要求继续合作，但是他拒绝和移民局以及FBI有任何深度合作。

凤姐要回来了！

下图为FBI在纽约法拉盛抓捕现场，凤姐的律师楼很不幸也在被扫荡的区域内。现在美国总统特朗普要求秋后算账，这些律师经手的案子，即使绿卡批准，即使已经变成美国公民，都需要被剥夺绿卡或者公民然后被驱逐回宗主国。

在这里我插句话，我实在是想不通凤姐那时候为什么要来美国，那时候她在国内的出场费都有三十万人民币，好好表现一年，都可以坐马斯克的火箭去月亮上看看了，别说移民美国，移民火星都很有这个经济实力。

而且凤姐居然还在微博上高调要火烧移民局，欺骗美国，说实话，来美国就没见过像凤姐这样子明目张胆的高调宣布要欺骗美国政府的。完全违背了某位智者说过的”闷声发大财“这个真理嘛。

还记得凤姐在国内说：“向前三百年，向后三百年，没有比我聪明的人”，真到了美国这个斗兽场，凤姐的表现的确叫人失望。

凤姐把装疯卖傻挣的点人气就换了个美国偷渡客的水平。同是卖脸皮,芙蓉姐姐不知道比她高到哪里去了。洗白上岸，北京置产，父母接到身边尽孝。打扮也利落。凤姐大概能吹的就是享受了美国的空气，不过你出去上班是给人洗脚，回来一个人住纽约地下室，空气再好也就是让悲催的生活再长一点罢了

网上流传了凤姐和芙蓉姐姐的一个笑话，就充分说明了两者之间的区别：

90岁的凤姐躺在床上，芙蓉进去看她。
芙蓉：“凤，逛夜店去不？”
凤姐答：“老了，逛不动了”
芙蓉又问：“兰蔻出新产品了，不去试试？”
凤姐答：“这岁数，用啥子也木得用咯”
芙蓉很无奈：“听说奥巴马向你求婚了！”
凤姐：“快！扶我起来……”

现在看来芙蓉姐姐是装傻，凤姐是真傻。

不管怎么样，她们的时代都已经过去了，不知道凤姐回国后，还坐的习惯高铁，用的习惯微信支付，骑的习惯单车，用的习惯淘宝吗。

也不知道凤姐到时候会不会想念美国甜美的空气。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。               图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言    目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO  酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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