利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑

CRISPR/Cas9简介

CRISPR 全称 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(成簇的规律间隔的短回文序列),该系统功能结构由三部分构成，crRNA,tracrRNA和Cas9（Crispr associated protein）蛋白,后为了便于使用，将crRNA与tracrRNA简化，统称为sgRNA（图1）。Cas9 具有两个活性酶切位点，RuvC(D10)和HNH(H840)活性结构域，因此野生型Cas9剪切能切断DNA双链，若活性位点突变（D10A，H840A）将导致该位点酶切活性缺失（Cas9n和dCas9），CRISPR 相关衍生基因编辑工具如 CRISPRi, CRISPRa, CRISPR methylation/demethylation 等都是对Cas9改造后与相关作用原件形成融合蛋白发挥作用（该部分内容后续将进行系列报导）。Cas9 除了发挥酶切活性，还具有寻靶功能：识别基因组DNA上的PAM序列-NGG。Cas9识别PAM序列，sgRNA识别结合靶序列，构成聚合体后，Cas9行使内切酶功能。Cas9切割位点位于sgRNA第17与第18碱基之间即近3’端PAM序列结合的DNA上。

图1 CRISPR/Cas9 系统结构示意图

切割形成DSB后,主要进行两种DNA修复（图2），由修复模板介导的精确修复即同源修复(HDR)和非同源修复（NHEJ），前者需要设计修复模板，主要用于敲入、替换或精确敲除，后者用于敲除，修复后可能产生缺失、插入和替换等。且HDR效率较低，如何提高HDR效率当前仍是较为棘手的问题。

图2 DSB 产生后的非同源修复和同源修复

以上是CRISPR/Cas9简介，接下来将系统性介绍如何运用该技术进行基因编辑。以Cas9-sgRNA 共表达质PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例，图3为利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图。

图3 利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图

在这里，我们对CRISPR/Cas9做了简单的介绍，下一个推文中，我们将会大家讲解sgRNA的设计以及sgRNA 表达载体构建，敬请期待！

参考文献：

Jinek, M., K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna and E. Charpentier (2012). "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science 337(6096): 816-821.

Ran, F. A., P. D. Hsu, J. Wright, V. Agarwala, D. A. Scott and F. Zhang (2013). "Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system." Nat Protoc 8(11): 2281-2308.