CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑(2)
sgRNA Design
上期简要介绍了CRISPR/Cas9系统的组成、结构及功能，以及利用该技术进行基因编辑的主要流程。本期将大家介绍如何有效设计sgRNA。
sgRNA 设计在线工具:
1．http://crispr.mit.edu/
2．http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/
3．http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html
4．http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
5．http://flycrispr.molbio.wisc.edu/
6．http://www.flyrnai.org/crispr/Drosophila/
7. http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
8. http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php
9. http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10. http://cas9.wicp.net/
11. http://cropbioengineering.iastate.edu/cgat
12.http://crispor.tefor.net/
sgRNA设计：
根据编辑位点，将该位点附近序列片段输入在线设计软件的input对话框中，选择位置合适以及脱靶效率较低的sgRNA。根据所选择的内切酶，在sgRNA(表达sgRNA的模板DNA)两端加上粘性末端接头。
5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’
例： 以质粒PX459 (pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例，Bbs1 酶切
1) 基因水平敲除: sgRNA尽量选择在启动子、功能比较重要或者序列比较保守的外显子上
2) 敲入: 特别是单碱基编辑，Cas9蛋白切割位点位于sgRNA第17与第18碱基之间即靠近3’端PAM序列, 选择的sgRNA使插入位点靠近Cas9蛋白切割位点。
以最后一款sgRNA设计工具crispor （http://crispor.tefor.net/）为例
Step1. 根据实验目的，将从数据库（NCBI 或Ensemble或 UCSC）得到的序列输入以下对话框，该在线设计工具crispor能输入的序列较长（<1000bp），张峰实验室开发的crispr（http://crispr.mit.edu/）对输入的序列长度范围则较窄（<250bp）
Step2. 选择你所需要的reference genome 版本。
Step3. 选择你所使用的Cas9系统，不同系统的‘PAM’有所不同
根据结果列表中，选择各项得分较高的sgRNA, 考虑off-target 预测位点所在的基因是否与目的基因功能相近，若相近则重选。
以上，sgRNA设计完成。
质粒获取：目前该技术已经很成熟，除了从addgene 获取（周期较长，且手续繁多），国内很多生物公司都能购买。
1）Cas9-sgRNA 共表达载体构建。以PX459 （pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0）为例。
a. SgRNA 合成后，磷酸激酶PNK磷酸化、退火。
b. PX459质粒双酶切，因该质粒有两个相邻的BbsI 酶切，且产生的粘性末端不互补，故该质粒只用BbsI 酶切即可。
c. 若SgRNA 为PCR合成，则sgRNA也需双酶切。
d. 酶连，转化，涂平板，摇菌，提质粒。注：根据质粒抗性基因加入抗生素。
2）PCR 验证sgRNA是否成功克隆到sgRNA表达载体中。以sgRNA 其中一条链为PCR引物，另一条自行设计。
3）sanger 测序验证sgRNA表达载体是否成功构建，测序引物与PCR引物同。