实例解读|高分文章|lncRNA-miRNA作用于心脏肥大

正如前面几期我们介绍的，lncRNA是当今生命科学研究中最热的领域之一。LncRNA在发育和基因表达中发挥着重要的作用，能够复杂精确的调控功能，极大地解释了基因组复杂性的难题。前面一期（什么鬼，lncRNA原来这么分析？）中，我们提到了一篇高分lncRNA论文（论文题目：The long noncoding RNA CHRF regulates cardiac hypertrophy by targeting miR-489，Circulation Research; 2014，114(9):1377-88. IF=13.965），当时作为实例，向大家展示了lncRNA如何通过调节miRNA参与疾病发生。

由于篇幅的原因，当时我们只是做了简单的介绍，但是很多小伙伴反映说，这篇文章很好，要详细介绍一下，这不，福利来了！

首先，我们和大家一起认识一下本文研究的疾病：心脏肥大（Cardiac hypertrophy）；它的英文定义：Cardiac hypertrophy is a thickening of the heart muscle (myocardium) which results in a decrease in size of the chamber of the heart, including the left and right ventricles. A common cause of cardiac hypertrophy is high blood pressure (hypertension) and heart valve stenosis. 也就是说高血压和心瓣膜狭窄是导致心脏肥大的常见因素。正常情况下，我们的心脏大小，与身高体重有关，体积跟我们的拳头大小差不多。从胸部X光片我们可以看到心脏在胸部中间偏左的位置。正常心脏的宽度占胸腔宽度的50%以下（心肺比）。胸部X光片对心肺比的测量常受到受检者吸气量不足的影响，造成相对性的心肥大；心电图的电波高低也可以告诉我们有没有心肥大，通常电波高就表示可能有心肥大。

心脏肥大常伴随着心脏重数异常，增大了心力衰竭的风险。因此，心脏异常肥大常被作为心力衰竭的治疗靶标。然而目前我们对心脏肥大产生的分子机制仍然不清楚。为了预防心力衰竭，我们很有必要发现调节心脏肥大的分子。

miRNA通过抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解能够负向调节基因的表达。不断增长的证据表明miRNA在生长、发育、增殖和凋亡中发挥重要作用。miRNA可以调节多种心脏功能，包括心脏肌肉收缩，心脏生长和心脏形态发生等，也可以参与调节心脏肥大。

lncRNA, 即长链非编码RNA；其长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。研究表明，lncRNA在表观遗传调控、剂量补偿效应、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要的作用。但是lncRNA是否能够参与调节心脏肥大仍不清楚。

鉴于miRNA和lncRNA具有多种生物学功能，近些年已经被广泛研究，因此本研究的目标是发现miR-489和lncRNA-CHRF在心脏肥大中的调节作用。

本文用到的主要实验方法：1. Cell culture; 2. qRT-PCR;  3. Western blots; 4. Adenoviral constructions and infection; 5. Transverse aortic constriction; 6. Histological assessments; 7. Immunochemistry。统计方法：1-way ANOVA对每个不同组之间进行比较；两组之间用Student t-test进行计算；p值小于0.05被认为统计学上显著。（由于篇幅的限制，下面只介绍主要结果）

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在细胞水平

MiR-489 能够抑制肥大

 Angiotensin II已被大量文献报道可以诱导心脏肥大发生，但分子机制仍不清楚。其中，miRNA可能在其中发挥重要作用。

基于心肌细胞，作者利用miRNA芯片分析发现对Angiotensin II的反应有9个miRNA显著下调，包括进化保守的miR-489。如下图：

作者又利用qRT-PCR验证了在心肌细胞里Angiotensin II能够诱导miR-489的表达下调。相反，强制表达miR-489导致肥大反应减少。如下图：

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在动物模型中

MiR-489可以拮抗心脏肥大

这里作者们构建了心肌特异性miR-489过表达的转基因小鼠。这些小鼠们可以正常地成长到成年，未发生明显心肌肥大。随后经过Angiotensin II肥大刺激，发现miR-489转基因小鼠表现较低的心肌肥大表型。

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Myd88是

miR-489的下游靶基因

正如前面所说，miRNA通过抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解能够负向调节基因的表达。 为了找到miR-489的靶基因，作者们利用荧光素酶检测筛选了与肥大相关的12个基因，包括Cyclin T, GSK3β, PKGI, Ras, MYL2, CSRP3, MCIP1, Foxo3a, Calcineurin, NFAT, Myocardin和Myd88；并利用生物信息学软件RNAhybrid分析每个mRNA序列的3’UTR。结果发现miR-489可以抑制Myd88基因的荧光素酶活性而对其它基因没有影响。结果如下：

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Myd88基因

传递肥大信号

在心肌细胞中，作者们发现了Angiotensin II肥大刺激增加了Myd88基因的表达。同样，在心脏横向主动脉老鼠模型和人类心力衰竭样本中，作者也发现Myd88基因表达水平显著增加。

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CHRF能够调节

miR-489表达和活性

How is miR-489 expression regulated under pathological conditions? lncRNA也许是作为endogenous sponge RNA与miRNA作用并影响miRNA的表达。为了找到是哪个lncRNA参与Angiotensin II处理的肥大通路，作者们利用Affymetrix公司的lncRNA芯片从心脏组织中筛选了100个中等表达的lncRNA。并用qRT-PCR发现lncRNA对Angiotensin II处理的反映。他们发现AK048451，即CHRF，表达显著上升，同时在心脏横向主动脉老鼠模型和人类心力衰竭样本中，也发现CHRF表达水平显著增加。通过荧光素酶活性检测，发现在心肌细胞中CHRF能够抵消miR-489的作用。如下图：

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CHRF能够

直接与miR-489结合

为了探索CHRF调节miR-489的机制，作者们检测CHRF是否直接与miR-489作用。利用RNAhybrid软件分析发现CHRF含有一个miR-489的作用靶点。再利用荧光素酶构建突变型Luc-CHRF-wt和野生型Luc-CHRF-mut。荧光素酶检测发现miR-489能够抑制CHRF RNA的荧光素酶活性，但是对于突变型和野生型之间的影响较小。且利用biotin-avidin pulldown system发现，CHRF能够直接与miR-489结合。

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CHRF可以通过

miR-489和Myd88调节肥大

接着作者们又利用knockdown， overexpression，luciferase reporter assay等一系列的实验发现CHRF能够通过miR-489/Myd88基因调节肥大。

小结：此前，人们已经发现miR-489在应对肥大刺激发生显著变化。接着，通过寻找miR-489下游靶基因，本文作者们发现miR-489能够调节Myd88基因的表达。miR-489通过靶标Myd88基因可以影响心脏肥大。在探索调节miR-489表达机制时，本文作者又发现CHRF（Cardiac hypertrophy related factor）可能作为endogenous sponge抑制miR-489的活性。通过研究分析，作者发现lncRNA-CHRF可以直接结合miR-489，使miR-489表达下调，并上调Myd88靶基因，促进心肌肥厚。 本文揭示了一个新的心肌肥厚的调节机制：CHRF – miR-489 – Myd88。即lncRNA CHRF作为竞争性內源RNA（ceRNA）参与miR-489调控Myd88基因在心脏肥大中的分子作用。本文LncRNA作用模式是lncRNA经典作用模式。lncRNA通过碱基互补配对吸附miRNA，使得miRNA功能丧失或降低，主要是影响了miRNA的表达丰度。