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Metformin是治疗二型糖尿病（T2D）最常用的处方药。尽管该药物过去一直被认为是通过肝脏内通路实现降糖，但是越来越多的证据表明metformin也可能通过肠内通路发挥作用。例如，有研究证明metformin对糖尿病治疗作用和肠道微生物的改变有关。但是metformin是如何影响T2D患者的肠道微生物群，以及该药物与肠道微生物群间的互作还是未知的。本文将新确诊为T2D的40例病人分为两组，分别服用placebo (n = 18)和metformin (n = 22)进行4个月的治疗。 4个月后对placebo组中的13个病人转用metformin继续治疗6个月。研究采集了病人的粪便、血液样本用于获取生化、宏基因组、宏转录组和代谢数据，还通过微生物实验、动物实验和肠模拟实验进行机制探索。
名称：Metformin alters the gut microbiome of individuals with treatment-naive type 2 diabetes, contributing to the therapeutic effects of the drug
译名：二甲双胍改变T2D患者肠道微生物组，促进药物疗效
期刊：Nature medicine
时间：2016
通讯作者：Fredrik Backhed
单位：瑞典哥德堡大学医学研究所
P0：placebo治疗前
P2：placebo两个月治疗
P4：placebo四个月治疗
M0：metformin治疗前
M2：metformin两个月治疗
M4：metformin四个月治疗
P/M6：placebo四个月治疗后转metformin继续治疗6个月
文章收集了两组病人治疗过程中的人体测量、生理生化数据并进行了差异性分析。两组病人均被推荐4个月的卡路里限制食谱。治疗前后，两组BMI都显著地减少。但是，糖化血红蛋白和血糖只在metformin治疗组中有显著的下降。
表1：治疗前后临床特征
图1：治疗前后BMI，糖化血红蛋白和血糖变化
该研究对131份粪便样本进行宏基因组测序分析。P4治疗后仅有一个菌株显著变化，而metformin组M2和M4治疗分别有81和86种菌株显著变化。相关分析发现M2和M4治疗后的微生物群变化和P/M6治疗后的微生物变化相关。文章在菌属水平进行微生物共丰度网络分析发现M2可提高菌属间的正相关关系的数量。
图2：菌株水平变化
图3：M2、M4、P/M6微生物变化相关分析
图4：菌属共丰度网络
3 KO分析，pathway富集分析，微生物生长分析
KO差异分析发现M2和M4中显著改变的KO绝大多数是overlap的。文章用显著变化的KO的相对丰度进行主坐标分析，placebo组的KO各个时间点位置相近，M0组在基线水平，M2和M4肠道位置有明显的变化。Pathway富集分析发现metformin治疗相关的基因富集在细菌环境应答，抗药性，碳水化合物代谢，氨基酸代谢，脂多糖生物合成等通路。通过计算微生物重复起始区域和末端区域的DNA拷贝数比值（PTR）来检测metformin对微生物生长的作用，发现双歧杆菌（B.adolescentis）PTR显著增加。细菌培养实验也证明，metformin存在时B.adolescentis生长的更快。
图5：M2和M4显著变化的KO
图6：主坐标分析和pathway富集分析
图7：metformin促进B.adolescentis生长
4Metformin治疗病人的肠道微生物可提高小鼠糖耐受
把3个病人的M0治疗前和M4治疗后的粪便分别移植给无菌小鼠，发现M4病人的粪便明显降低小鼠血糖，证明了metformin可以通过改变肠道微生物控制血糖。
图8：粪便移植小鼠的血糖浓度变化
尽管人们还不清楚肠道微生物群是如何作用于宿主的，但是其中的机制可能是于乙酸盐（Acetate），丙酸盐（Propionate），丁酸盐（Butyrate）等短链脂肪酸（SCFA）的增加有关。因此，文章进行了代谢分析。通过和placebo组进行比较，发现M4男性样本中粪便的乙酸盐和丁酸盐都显著的增加。文章还观察到粪便中乳酸盐（Lactate）浓度显著的增加，琥珀酸盐（Succinate）有增加的趋势。
肠道微生物群是肠道胆汁酸代谢的重要调节器，它对宿主代谢可能也起作用。而且，已经有一些研究证明metformin可能参与调节胆汁酸，但是他们的联系并未完善。文章在此处分析了M4粪便和血浆胆汁酸的变化。粪便胆汁酸无显著的改变，但是相较于placebo组血浆胆汁酸（总，初级，次级和未结合型）都有显著的增加。宏基因组分析发现胆盐水解酶bsh（M2 ：M0）丰度显著增加。这些水解酶是由肠道微生物群产生的，他们能催化甘氨酸和牛磺酸结合的胆汁酸水解增加非结合型胆汁酸的浓度。
图9： SCFA代谢物变化
图10：胆汁酸变化
文章用肠道模拟器分别培养了两个病人（donors 13和49）metformin治疗前的粪便样本。用metformin处理一周，通过全基因组和转录组测序进行微生物组分析。分析发现donor 13有24个菌株的DNA和RNA丰度发生显著的变化，donor 49只有4个。其中A. muciniphila是唯一一个在两个样本中DNA和RNA丰度都明显增加的分类单元。宏基因组和宏转录组功能分析发现metformin处理后donor 13和donor 49的样本分别有686和909 KO的丰度显著改变，以及31和38个显著富集pathway，其中有22个是overlap的。而且，这些pathway中的6个在前面也被富集到。文章用donor 13的体外培养的粪便样本进行转录组分析来研究metformin和菌种间的直接互作。首先，文章检测了map到A. muciniphila分类单元的RNA reads，发现有A. muciniphila中有207的编码基因受到metformin的调节，其中有65%的是下调的（FDR < 0.1）。注释后发现这207个基因中有108个需要辅酶或辅因子，如：ATP，FAD，FMN，metal，NAD和维生素B6。有趣的是，这108个基因中有81个编码金属蛋白和金属转运体。GO分析证明这些基因的产物富集在金属离子结合蛋白，转运酶，水解酶，配体和核糖体蛋白成分中。
图11：微生物成分分析和pathway富集分析
图12：pathway和分子功能注释circos图以及GO富集分析图
虽然该研究只纳入40例T2D病人，但是它在各个治疗时间点均收集了每个病人的人体测量数据，生化数据，宏基因组测序数据，还检测了M0, M4, P0, P4病人血液和粪便胆汁酸以及粪便短链脂肪酸。PTR分析发现metformin能促进B.adolescentis的生长，体外微生物培养实验验证了metformin存在时B.adolescentis生长的更快。宏基因组分析发现metformin能显著的改变肠道内一些细菌的数量，通过观察移植metformin治疗前后的病人粪便的无菌鼠的血糖变化发现metformin很可能是通过改变肠道菌群从而影响小鼠血糖的。该研究选取两个治疗前的粪便样本放在肠道模拟器中培养并用metformin处理，然后对处理前后的粪便进行宏基因组和转录组分析，发现A. muciniphila在DNA和RNA都明显变化，进一步分析发现A. muciniphila中受metformin调节的207个基因中有81个和金属稳态调节有关，所以metformin和可能是通过改变肠道菌群金属稳态影响菌群结构以及宿主代谢。