基因治疗重返舞台 医疗大势所趋

来源：2016-6-30 生命奥秘杂志

最近，多项有关基因治疗的临床试验数据都表明其具有显著的治疗效果，并具备卓越的安全性。长久以来，科学家们一直致力于找到相应的途径，采用基因疗法，以帮助身患绝症或者严重致残的患者重获健康，上述试验结果恰恰为此提供了数据支持。在这些进展背后，最重要的是载体设计技术的提高与革新，保证了将治疗性基因安全植入特定细胞内的安全性。此外，还有多种其它技术的发展，也对基因治疗的复兴起到了关键的作用：例如，基因剪接及修复遗传性基因突变；采用干细胞制备各类组织，促进机体有效启动强有力的免疫应答来对抗癌症等。

长期以来，由于基因疗法具有从根源上医治疾病的潜力，从而对科学家、临床医生乃至公众都有着格外的吸引力。基因疗法通过对抗细胞内功能失常的基因，或者直接将其替换而发挥治疗作用。尽管从理论上而言，其原理十分简单，但在真正实施的过程中所遇到的种种障碍，却让人十分气馁。事实上，基因转移过程中，必须越过细胞及组织内复杂的重重壁垒，才能将新的遗传信息成功导入目标细胞，启动具有治疗功能的分子表达，而不干扰基本调节机制。还要必须保证基因修复细胞具有足够多的数量，逃过免疫识别，并且可以长期存活，或者能够将其修复功能传递给后代细胞，才能起到治疗作用。在过去的二十年里，科学家们针对遗传性疾病、癌症及慢性感染进行了若干基因治疗的临床试验。其中，只有少数结果显示具有明确的临床疗效，而在其它一些试验中，患者出现了与载体相关的严重副作用。这些令人失望的结果，让人们对基因疗法产生了忧虑和怀疑的态度。但是，这种情况正在发生根本性的转变。最近，一批基因治疗I 期和II 期临床试验的结果表明，在治疗许多严重的血液、免疫、神经系统等遗传性疾病方面，基因治疗是具有显著的疗效和可靠的安全性的。这些疾病包括：原发性免疫缺陷疾病、脑白质营养不良、地中海贫血、血友病及视网膜营养不良性萎缩，此外包括B 细胞恶性肿瘤等（表1 ）。在所有这些试验中，都采用了改进后的载体技术，将治疗性基因转移入细胞。在某些试验中，遗传物质在体外被转移到造血干细胞（HSC）或T 淋巴细胞（T cell ）；而另一些试验则在体内将遗传物质靶向转移至肝脏内的肝细胞或视网膜上的感光细胞。本文将对相关性最高的临床结果进行综述，重点介绍基因转移技术领域内的新进展，及我们对与此相关的生物学过程的深层次的理解，并就基因治疗的挑战及前景进行讨论。

表1 基因治疗临床试验一览表

所治疗疾病	所用载体及治疗策略	入组患者人数	随访 时间 （月）	患者状态以及临床和生物学结局	临床试验编号
以造血干细胞为基础的基因治疗
Wiskott–Aldrich综合症	慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略	7	10~60	所有患者皆存活，且状态良好。转基因细胞在体内非常稳定，临床获益相当稳定，且安全性良好。	NCT01515462
Wiskott–Aldrich综合症	慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略	7	9 ~ 42	6 名患者皆存活，且状态良好。1 名患者死于之前就已经存在的感染，转基因细胞在体内非常稳定，临床获益相当稳定且安全性良好	NCT01347242 NCT01347346 NCT02333760
X染色体连锁重度联合 免疫缺陷症	自我失活γ逆转录病毒载体、CD34 + 细胞体外基因转移策略	9	12~39	8名患者皆存活，且状态良好。1名患者死于感染，转基因细胞在体内非常稳定；7名患者临床获益相当稳定，且安全性良好；1名患者转基因细胞移植失败，转而接受造血干细胞移植治疗	NCT01410019 NCT01175239 NCT01129544
重型β地中海贫血	慢病毒载体、CD34 + 细胞体外基因转移策略	3	24~72	2名患者转基因细胞在体内非常稳定。其中1名患者不再需要输血治疗；1名患者转基因细胞移植失败，需要输血治疗	不适用
重型β地中海贫血	慢病毒载体、CD34 + 细胞体外基因转移策略	2	15	转基因细胞在体内非常稳定；2名 患者不再需要输血治疗，且治疗 安全性良好	NCT02151526
重型β地中海贫血	慢病毒载体、CD34 + 细胞体外基因转移策略	5	1~6	转基因细胞在体内非常稳定。其中2名最先接受疗效评估的患者不再需要输血治疗，且治疗安全性良好	NCT01745120
肾上腺脑白质营养不良	慢病毒载体、CD34 + 细胞体外基因转移策略	4	54~101	转基因细胞在体内非常稳定。其中3名患者获得稳定临床获益，且所有患者治疗安全性良好	不适用
异染性脑白质营养不良	慢病毒载体、CD34 + 细 胞体外基因转移策略	20	3~60	转基因细胞在体内非常稳定。所有在婴儿期末，尚未表现出临床症状时即接受治疗的患者均获得稳定临床获益，且所有患者治疗安全性良好	NCT01560182
肝脏定向基因治疗
乙型血友病	AAV8载体，静脉输注	10	16~48	没有抑制剂，凝血因子IX持续表达，在给药（外源基因）剂量较高的6名患者中，平均凝血因子IX水平为5.1±1.7%	NCT00979238
乙型血友病	AAV8载体，静脉输注	7	≤12	没有抑制剂，其中1名患者持续表达凝血因子IX	NCT01687608
T细胞免疫疗法治疗肿瘤
B 细胞淋巴瘤或慢性淋巴细 胞白血病	γ逆转录病毒载体、T 细胞体外基因转移策 略，嵌合抗原受体修饰 抗CD19细胞	15	1 ~ 23	其中8 人完全起反应，4 人部分起反应，总体起效率达到80%	NCT0092432
B 细胞急性淋巴细胞白血病	γ逆转录病毒载体、T 细胞体外基因转移策 略，嵌合抗原受体修饰 抗CD19细胞	5	1 ~ 4	5 人均完全起反应，总体起效率达到100 % 。其中4 人根据临床试验设计随即接受造血干细胞移植；1 人由于条件不适合，没有接受造血干细胞移植，病情复发	NCT01044069
B 细胞急性淋巴细胞白血病	慢病毒载体、T 细胞体 外基因转移策略，嵌合 抗原受体修饰抗CD19 细胞	30	1 ~ 24（平均随访时 间为7 个月）	其中27人完全起反应，总体起效率达到90% 。19人病情得到缓解，其中有3  人接受了造血干细胞移植；7 人病情复发，其中有3  人是在转基 因T 细胞消失之后复发	NCT01626495 NCT01029366
B 细胞急性淋巴细胞白血病 或淋巴瘤	γ逆转录病毒载体、T 细胞体外基因转移策 略，嵌合抗原受体修饰 抗CD19细胞	21	平均随访时间为10个 月。	其中14人完全起效（第28天时），总体起效率达到67% ，10人接受造血干细胞移植，接受造血干细胞 移植平均时间为51天	NCT01593696
视网膜基因治疗
2 型伯氏先天性黑蒙	AAV2 载体，单侧视网 膜下注射	5	36	所有5 名患者视敏度均有稳定改善	NCT00516477
2 型伯氏先天性黑蒙	AAV2 载体，单侧视网 膜下注射	3	54~ 72	所有3 名患者在6 个月时视敏度均有稳定改善，并且在1 ~ 3 年内得到进一步改善，随后开始下降	NCT00481546
2 型伯氏先天性黑蒙	AAV2 载体，单侧视网 膜下注射	12	36	6 名患者视敏度均有稳定改善，最佳效果出现在治疗后6 ~ 12个月，随后开始下降	NCT00643747

造血干细胞基因治疗

HSC一直以来都是体外基因治疗技术中的首选靶标。具有自我更新能力的多能干细胞HSC内的遗传修饰，可以保证在体内稳定地供给其基因已经得到矫正的后代细胞。这些细胞可以在成熟造血细胞系停止发育，或者出现功能障碍时，发挥纠错的功能。考虑到HSC的自我更新性质，以及必须确保遗传修饰被传递给它们的后代细胞，基因矫正必须采用载体介导的转基因插入技术，或者体内基因剪接技术引入到细胞内的染色质上。

已经进行的相关HSC基因治疗试验结果表明，某些疾病的患者可以从此类疗法中获益，证实基因疗法有发展潜力。但是，他们也指出，采用基于γ逆转录病毒（γ-RV ）的早期载体，是有明显的局限性和风险的。比如说，这些技术在转导基因进入大部分原始祖细胞的过程中，只能发挥有限的作用，这就导致体内携带矫正基因的造血细胞的数目很少且持续时间短暂。在长期跟踪研究中发现，有些患者会出现原癌基因附近载体插入所导致的白血病。因此，在临床前期模型中，寻找发展具有更高疗效及安全性的载体，例如慢病毒载体，使人们重新把目光投向基因治疗。

采用新载体的HSC基因疗法，已经在多个遗传性疾病中进行了试验，这些疾病包括免疫系统疾病Wiskott–Aldrich综合症（WAS）、X 连锁严重联合免疫缺陷病（SCID-X1 ）、血液病（β地中海贫血）、神经退行性疾病（肾上腺脑白质营养不良症及异染色体脑白质营养不良症）（表1 ）。患有SCID-X1 的儿童，其免疫系统发育迟缓且功能受损，这是由于患儿体内缺少某些免疫细胞发育所必需的细胞因子受体。而那些WAS患者则缺少细胞骨架接头，无法组装免疫突触。患上述两种疾病的孩子，都非常容易发生感染，而WAS患儿还由于血小板数目减低，易出现大出血。重型β地中海贫血患者体内无法表达血红蛋白β链，从而导致有缺陷的红细胞生成，易发生溶血，进而导致严重贫血，需要频繁输血治疗及服用铁螯合剂。肾上腺脑白质营养不良症或异染色质脑白质营养不良症患儿在早期会出现髓鞘发育异常，累积中枢及外周神经系统的神经胶质及神经细胞随之退化。他们无法分解髓鞘质的某些代谢产物，对肾上腺脑白质营养不良症患者来说，这是因为过氧化物酶ATP 结合级联转运因子出现缺陷造成的；至于异染色质脑白质营养不良症，则是因为溶酶体酶芳基硫酸酯酶A 的缺陷所导致。此类患者的运动、感觉及认知功能会出现快速且不可逆转的退化，随后在数年内死亡。HSC移植中，HSC被从健康捐献者转移到患有某种疾病的接受者，基本可以使SCID-X1 、WAS及β地中海贫血患者获得治愈。如果HSC移植在脑白质营养不良症发病之前，或者在刚刚开始发病时就实施，是可以终止疾病进展的。不过，相较而言，肾上腺脑白质营养不良症患者的治疗效果更加令人满意。异体HSC移植可能会有相当大的风险使接受移植者患病甚至死亡，尤其是当捐献方和接受方的人白细胞抗原（HLA ）不匹配时。在极少数情况下，即使双方均是来自同一个家庭的成员，其HLA 也相互匹配，患病风险仍然很高。HSC基因治疗可以解决上述问题，尤其是当无法寻找到相互匹配的HSC捐献方时。 

在HSC基因治疗中，先在体外将基因转移至造血祖细胞内。首先，采用CD34表面标记物对细胞进行纯化，将其和来自患者骨髓或者流动的外周血的白细胞分开。接下来，将纯化所得细胞在生长刺激性细胞因子环境内培养2 - 4 天，在此过程中，暴露于具有矫正转基因表达功能的载体。在接受矫正细胞转移至体内之前，患者应预先接受相应的化学药物治疗。如此可以减少骨髓内内源性祖细胞及分化细胞的数目，在某些情况下，还包括减少淋巴器官内上述细胞的数目，从而有利于来自体外的、携带矫正转基因细胞的成功植入。患者预先接受化学药物治疗，会导致相当比例的患者提早患病，这主要是由于暂时的血细胞数目减少、免疫缺陷及粘膜损伤等，提高了患者发生严重感染的风险。此外，化学药物治疗也可导致迟发的疾病，例如继发性肿瘤、不孕不育症等。已经有一些HSC基因治疗试验，致力于降低由于患者接受预先治疗所导致的患病率，研究者尝试通过降低用药剂量，以及联合用药的方式来解决这些问题。还有一些化疗药物，会减少患者中枢神经系统内小胶质细胞祖细胞的数目。对于接受了HSC基因治疗的脑白质营养不良症患者，上述细胞会被基因矫正细胞所取代，当基因矫正细胞到达中枢神经系统组织时，产生正常功能的后代细胞，会清除累积的髓鞘质代谢产物。在异染色质脑白质营养不良症患者体内，这些携带矫正基因的细胞也会释放功能性溶酶体酶对其它组织内细胞进行矫正。

所有采用慢病毒载体所进行的HSC基因治疗试验结果都表明，在大部分患者体内，都可见到稳定、高水平的造血细胞的再生。所有被检测的造血系细胞（单核细胞、巨噬细胞、红细胞、自然杀伤细胞、B 淋巴细胞和T 细胞）都含有基因矫正细胞，并稳定地接受新形成的矫正细胞的输入——在寿命较短的髓系细胞内最为明显——可见，基因移植一定发生在可以自我更新、具有多潜能的祖细胞内，这些细胞有效地被移入患者体内。含有基因矫正细胞的造血细胞系统的重建情况，随患者和试验的不同而有所不同。这反映了疾病及其矫正对不同造血系细胞的不同影响，此外，载体批次不同，患者所接受的预先药物治疗等因素也会带来相应的影响。应该指出的是，大部分患者在成功接受了异体基因捐献者的HSC移植后可以获得超过想象的益处。这在异基因型脑白质营养不良症的临床试验中尤其突出。该试验的原理是，基因转移可以驱动造血细胞相较正常细胞有更高水平的溶酶体酶的表达，从而使这些细胞能够提供更多的酶类，进而影响组织。这一方法克服了HSC在治疗上述疾病时所遇到的困境，从而获得了令人较为满意的结果。尽管越来越多的患者参与到此类HSC基因治疗的试验中（表1 ），却还未见到有研究者报告与慢病毒载体相关的副作用。在最近的一项针对参与试验者的跟踪研究中发现，那些成功获得矫正细胞的患者，目前都处于良好的状况——也就是说，在接受治疗后，这些患者要么已经康复，要么症状有所缓解——几乎过着成常人的生活，其中首个接受此类治疗的患者，在大约七年前就参加了肾上腺脑白质营养不良症的临床试验。如果未曾接受基因治疗，这些患者可能已经死于该疾病了。

肝脏导向的基因治疗

肝脏一直以来都是体内基因治疗的首选靶标。作为主要内脏和体内的核心代谢器官，肝脏通过含有高通透性管壁的血窦结构接收大量的血供，这一结构有利于吸收来自血液的各类微粒，例如病毒等进入肝细胞。肝细胞寿命长，并且是高效的蛋白工厂，可以有效地将其“产品”释放到血液循环中去。因此，稳定地将转基因传递至肝脏，不失为一种有效策略，可用于治疗若干遗传性代谢疾病、血浆蛋白功能缺陷，尤其是那些与凝血因子有关的疾病。肝脏导向基因治疗的主要障碍是，向患者血液内注入病毒颗粒后，可能会由于严重的炎症反应而导致毒性；也有可能在患者血液内已经存在病毒特异性抗体，使注入的病毒颗粒失活；此外，病毒也可能被存在于肝脏和脾脏的巨噬细胞清除掉。如果体液或细胞免疫被转基因产物激活，那么，基因治疗的效果就会在血液循环中被遏制，矫正细胞也有可能会被细胞毒性T 细胞杀死。

肝脏导向基因治疗主要被用于严重的B 型血友病方面的研究，其中，通常采用来源于人的细小病毒和腺相关病毒（AAV ）。经血管注射入体内后，部分AAV载体血清型可以有效靶向到达肝细胞，并与矫正细胞保持稳定的关联，大部分在细胞核内以非整合的游离体形式存在。在动物模型中，这种基因转移策略没有使机体启动针对转基因产物的免疫应答，相反，还建立了转基因特异性耐受。在非增殖性肝细胞内，包含凝血因子IX （FIX ）的AAV 载体基因组持续存在，可以保证正常功能的FIX 向血液循环中稳定供应，FIX是一种在B 型血友病患者体内缺失或存在缺陷的蛋白质。只要患者体内的FIX 表达水平达到正常水平的1 % ，就足以将严重B 型血友病转变成轻型。这种功能上的部分重建，有利于减少自发性出血的风险，因为出血对关节是不利的，如果发生在大脑，还可能致命。此外，上述治疗还可以减少通过静脉输入预防疾病因子替换性治疗的需要，这类输注治疗对于患者而言是一个巨大的经济负担，费用高昂，而且只有在卫生体系非常健全的发达国家才能获得。尽管早期的临床试验就报告了向血液内输注AAV 载体的安全性，但其FIX 表达十分有限且短暂。这可能是由于肝脏内基因转导的水平很低，也可能是持续存在于矫正性肝细胞内的AAV 组分，启动了延迟的细胞内免疫应答，从而被消除。最近，有研究者采用了一种新的AAV 血清型（AAV8 ），并且改进了蛋白表达策略，从而克服了上述局限性。结果显示，在单一一次耐受量好的外周静脉输注后，载体剂量依赖性FIX 表达可以达到正常水平的6 %。三年后，FIX 表达在大部分患者体内依然稳定，尽管有些患者，在接受治疗后的4 - 8 周内会出现肝细胞损伤，但可通过给予短暂的皮质激素类治疗来缓解。大部分接受治疗的患者，都可以减少或者不再需要预防疾病因子替换性治疗，生活质量得以大大提高。

T 细胞免疫疗法治疗肿瘤

T 细胞也是在体外基因治疗中首选的热门改造细胞。T 细胞免疫疗法主要用于激活后天免疫反应，可以治疗肿瘤或HIV 病毒感染等慢性感染性疾病。从患者的外周血中就能很容易地获得自体T 细胞，并且在体外就能够进行培养和扩增。培养扩增以后用能够表达外源T 细胞抗原受体（T-cellantigen receptor, TCR）的γ逆转录病毒或慢病毒等载体转染进T 细胞，完成基因改造，最后将改造好的T 细胞再回输给患者，这些TCR就能够特异性识别肿瘤抗原或抗病毒分子了。之所以会选择T 细胞作为改造目标是因为在用自体淋巴细胞回输技术对晚期黑色素瘤患者进行治疗时观察到了意义重大的、特定的肿瘤反应，这种肿瘤反应有时甚至会让肿瘤彻底消退。这种治疗作用可能与细胞在体外被激活和扩增有关，因为体内原本也存在少量肿瘤细胞特异性的细胞毒性T细胞，只不过被体内的微环境抑制住了。这些现象表明，后天免疫反应在肿瘤治疗中的应用潜力还是相当大的，只需要使其脱离抑制信号，并且回输大量的反应性T 细胞就能够达到一个比较好的效应靶标比（effector–target ratio）。先用去淋巴细胞药物（lymphoid-depleting regimen）对患者进行预处理，然后再回输经改造的T 细胞，这样也有助于提高T 细胞的植入效率及活性。

将外源性TCR转移至T 细胞就能够免掉在患者自身T 细胞中寻找已经存在的肿瘤特异性T细胞的步骤，还可以好好利用人工合成技术，合成出高亲和力的TCR，而在体内必须经由胸腺的选择作用才能最终筛选出合格的TCR，决定自体细胞的免疫特异性。理想状态下，这种TCR会锁定自体蛋白中的肿瘤相关抗原，比如癌胚抗原或睾丸抗原等，正常组织此时不会表达，或者即便表达也检测不到自体蛋白。此外，它们还可以瞄准通常只见于某种特定肿瘤的致癌突变（“司机”突变），这些突变即便能够躲过免疫攻击，也是不会丧失的。不过最近的研究发现，大部分天然免疫反应或后天的、肿瘤特异性免疫反应针对的都是继发的“乘客”突变抗原，这种突变是肿瘤细胞内的随机突变不断积累而来的。因此，这种免疫疗法必须是高度个性化的治疗策略，既需要根据肿瘤的外显子组或蛋白质组信息来确定可能的“乘客”突变抗原，同时还需要利用专门的T细胞遗传工程学改造技术获得同源TCR识别序列。

有关T 细胞免疫疗法治疗肿瘤的早期临床试验发现，虽然使用了针对肿瘤相关抗原的TCR，但也只针对部分肿瘤有反应，甚至在某些时候还会出现脱靶的现象，甚至导致组织损伤等严重的副作用。最近，研究人员又开始利用基因转移技术给T 细胞导入人工合成的嵌合抗原受体（chimaeric antigen receptors, CAR）。CAR能够同时兼具肿瘤相关表面分子结合抗体的作用，以及一个或多个TCR和共刺激受体复合体（costimulatoryreceptor complexes）胞内信号结构域的作用。这种CAR策略与传统的TCR策略相比有诸多优势。比如，在抗原识别方面不再限于HLA抗原，之前已经被证明是安全、而且特异性很高的体内识别抗体也可以通过单链抗体衍生物（single chain antibody derivatives）的形式被加入到CAR当中。而且，这些经过改造的T细胞在遭遇靶标之后都能够被充分激活。在使用了特异性针对B 细胞表面分子CD19的CAR外源基因的临床试验中发现，B 细胞肿瘤患者获得了明显的临床获益，甚至有患者的病情达到完全临床缓解，而且耐受良好，毒副作用都在可控范围之内。这些结果都激起了大家强烈的兴趣，为后续的发展打下了良好的基础。

为什么最近开展的临床试验能够取得成功？

本文介绍的临床试验都取得了不错的研究结果，大部分都获得了较长期的证据能够表明，基因治疗可以为患者提供持久的治疗获益，有些甚至能够“治愈”疾病，当然，也有一些单次基因治疗是以失败告终的。这些正向的临床试验结果主要得益于所用载体的合理改进，比如我们在背景知识框1 和2 中介绍的慢病毒载体和腺相关病毒载体。载体制备和鉴定技术的发展使载体的纯度和效力都有了较大幅度的提升，这也提高了细胞转染的成功率，同时也降低了不良反应的发生率，尽管与之前试验中使用了同样的载体设计方案。对靶标细胞生物学特性的进一步了解也是决定基因治疗成败的关键，因为这些知识有助于我们对细胞进行体外处理，也可以对病人的状况进行更好、更有效的监测和管理。实际上，最近这些临床试验之所以能够取得成功，还得益于更细致的临床观察，以及更有效的分子监测，这些让我们能够用更确切的证据去把握基因治疗的疗效和安全性。

在最近开展的以慢病毒载体为基础的造血干细胞基因治疗临床试验里，就用到了载体插入式分析（vector insertional analysis）来跟踪每一个重组造血干细胞克隆，结果发现，被转染的干细胞发生了多克隆重组（polyclonal reconstitution ），但是并没有出现因为发生了获得功能的载体插入突变而形成的占据绝对优势的克隆。目前正在对涉及多种疾病的重组造血干细胞进行更加深入的分析，其中就包括在之前使用了其它几种载体的疾病，这也是我们第一次开展这种针对不同载体的对比研究。现有的证据表明，最近几次临床试验之所以没有发生不良的反应和结果，是因为患者体内载体插入的形式有所不同。在以前的临床试验当中，主要使用长终末重复（long terminal repeat, LTR ）γ逆转录病毒载体，经常会在很早就形成优势克隆，而这恰恰是因为载体插入的靶标肿瘤基因的表达发生了改变造成的。

但是，在引入了慢病毒等具有自我失活LTR ，以及不同插入位点的新型载体之后，就很难再观察到这种情况了。同样，在以前的实验中发现的逆转录病毒重组会导致白血病的证据表明，载体插入就是导致基因治疗后白血病发病的潜在原因。在扩增克隆中不断积累的、与载体无关的突变也会导致疾病的进展，同时发生的寡克隆重建（oligoclonal reconstitution ）、选择压力、转基因毒性作用或疾病导致的异常造血作用也都有利于疾病的进展。综上所述，这些研究成果都表明，提高造血干细胞转染及移植的效率，采用更好的载体设计策略都会极大地降低基因毒性作用（genotoxicity ），但还是不能彻底清除这种作用。一旦发现，载体插入作用对细胞的行为基本上只会带来中性作用，那么在重组造血作用中跟踪克隆活性就能够极大地突出造血再生功能的重要生理学意义。这包括转染造血干细胞的作用模式及稳定性，因为它是预测长期疗效的基础。克隆跟踪还有助于证实谱系关系（lineage relationship）与造血系统疾病模型的可靠性，因为目前这种模型都是以异种移植研究为基础的。

有一群T 记忆干细胞（T memory stem cell ）对适应性T 细胞治疗（adoptive T-cell therapy ）的远期疗效起到了关键性的决定作用。我们是通过对T 细胞分化通路的进一步了解，对相关表型的深入认识，以及对在体内持续产生效应子的细胞的发现，才发现这种重要作用的。优化体外细胞培养技术和体内基因标记T 细胞跟踪技术也帮了大忙，这些进步都有利于设计出更高效的实验。对接受了适应性T细胞治疗及细胞周期阻滞治疗的癌症患者进行抗原表位作图和肿瘤特异性T 细胞跟踪也能够帮助我们找到一些直接的证据，证明有可能在患有某些肿瘤的患者体内激发肿瘤特异性的效应T 细胞，继而通过体外扩增或遗传编辑等操作来清除他们体内的晚期肿瘤转移灶。

在肝定向基因治疗当中，对针对进入体内的AAV 病毒载体的抗病毒T 细胞反应进行仔细的抗原表位特异性免疫监测，也可以帮助我们预测凝血因子IX是否能够长期、稳定的表达。这些都有助于我们开发用于控制针对病毒载体的延迟细胞毒后天免疫反应（delayed cytotoxic adaptive response）的新策略，比如可以在出现免疫反应之后立即短期使用免疫抑制剂，或者对病毒载体的衣壳蛋白进行改造，使其躲过免疫反应的攻击等等。

在最近开展的基因治疗临床试验中观察到的不错结果还反映出在实验设计方案上的改进。这可能是因为对病毒载体与人体的相互作用有了更加深入的了解，也可能是因为采用了更加合理的患者入组标准，在验证了载体在人体中的安全性之后，再进行临床试验比较容易达到预期效果。更好的试验设计可以从多个方面提高试验效果。比如，招募只表现出早期症状（甚至是尚未表现出症状）的患者参加试验，而不是进展至疾病晚期的患者参加试验，也就是说在疾病尚未对人体组织造成不可逆损伤之前对疾病进行干预，更加有可能获得更好的治疗效果。在治疗时使用载体的剂量也可以设定到治疗剂量，而不是像以往在1 期或2 期临床试验时为了尽可能降低试验风险，使用的最小生物学活性剂量。这种谨慎的策略往往会让受试者无法立即获得治疗获益，可能也无法获得远期获益（因为他们可能会对病毒载体产生免疫反应）。如果使用更加大胆的预处理方案，则可以为基因改造细胞留出更多的空间。载体导致的副作用也可以用药物进行处置，比如使用抗炎药物或类固醇类药物来分别抑制先天或后天免疫反应等。

基因治疗临床试验往往是用于治疗罕见疾病，而我们对这些疾病的自然病程或基因型与表型之间的关系知之甚少。更多地了解相关的知识有助于我们设计出更好的试验方案，这样我们可以据此找出更多、更有可能通过基因治疗获得帮助的患者来参加临床试验。还可以根据在一段时间之内达到的有效终点来评价试验疗效，这些都有助于开发后续的治疗策略。

未来面临的挑战及潜在发展机遇

在造血干细胞治疗中，尽管在载体设计等方面有了一定的改善，但是在未来的发展当中，如何判断载体插入风险，如何解决每一个病人的相应风险，如何通过更好的载体设计来避免这种风险依旧是需要解决的主要问题。目前已经建立了多种实验模型，用来评价不同载体，以及不同载体设计方案的相对遗传毒性，还可以根据遗传毒性进行分级。尽管这些工作为推动载体进入临床实验提供了更可靠的依据，但还是无法为基因治疗的实际致癌风险提供一个量化的评价指标，也很难对某一个临床实验中用到的某一种载体提供一个实际的遗传毒性风险评价结果，这些问题在参加临床实验患者人数较少时显得尤为明显。因为这种临床实验往往需要更长的随访观察期，而这些患者所患的疾病也同样会增加肿瘤的发生风险。只要我们使用的载体能够插入并整合进人体的基因组，在插入位点处就有可能会发生基因激活或失活，因此我们只能在一定程度上缓解这种可能性，但是无法彻底消除这种可能性。虽然更好的载体，以及更好的设计有可能会降低这方面的风险，但显性突变这种较高的风险，还是会存在使抑癌基因失活的可能性。这些发生几率较低的隐性突变只有经过大规模的临床实验，或者更长时间的临床观察才有可能被发现。

如果大型临床实验和长时间的临床观察都证实了基因治疗的安全性和疗效，那么造血干细胞基因治疗就有望取代目前在单基因疾病（monogenic diseases ）治疗领域占主导地位的造血干细胞移植技术。实际上，使用自体造血干细胞才是让所有患者都有可能获益的一种途径。而且，造血干细胞移植只能帮助那些能够找到配型合适捐赠者的患者。与此同时，造血干细胞基因治疗还能够极大地降低死亡率，因为它能够避免移植免疫排斥的问题，同时也不需要像造血干细胞移植那样，在术后使用免疫抑制药物。另外，有了基因治疗之后，还可以使用更加温和的预处理方式，因为在基因修饰细胞存在的时间里，部分的嵌合体（partial chimaerism ）也足够治疗疾病了，因此患者就不再需要承受骨髓细胞或淋巴细胞去除预处理的风险了。如果造血干细胞移植的效果还不够满意，经过遗传修饰的造血干细胞还可能开发出新的治疗手段。比如可以增加治疗基因的剂量（正如前面在介绍异染色质脑白质营养不良治疗时提到的那样），或者进行定向转基因治疗（比如在治疗异染色质脑白质营养不良时对中枢神经系统进行定向给药）。外源遗传信息也能用于造血干细胞及其应用范围，帮助我们更好地应对肿瘤或慢性感染等疾病。随着对越来越多不治之症处置手段的增加，对新出生婴儿进行基因组筛查也有助于我们对这些疾病进行早期诊断和处置。为了试验这一美好的设想，体外遗传修饰和造血干细胞及其祖细胞体外培养技术必须变得更加可靠和有效，细胞体外培养和扩增技术也必须更加完善，这样才有助于细胞在患者体内更快地恢复造血功能，提高其克隆数、适应力和稳定性，从而提高基因治疗长期和短期的安全性。如果达到了预期的治疗获益，就可以使用毒性更低的药物。这样才能够让患者不再需要承受目前使用化疗药物时需要承受的长期和短期毒性作用。

至于用T 细胞免疫疗法治疗肿瘤，虽然有越来越多的CAR在开展临床试验进行测试，但是大部分临床试验主要针对的都是用B 细胞表面抗原的CAR治疗B 细胞恶性肿瘤。值得注意的是，使用这种方法不仅会清除癌变的B 细胞，同样也会清除患者体内其它的B 细胞。虽然也可以用注射免疫球蛋白等方法处置缺少B细胞带来的不良后果，但是如果还误伤了其它细胞，目前还没有解决方案。这个问题会限制CAR的应用，比如其它特异性的抗原也可能无法用作CAR的识别靶标。此外，在临床试验中观察到在清除大量肿瘤组织的同时，还会伴有急性、甚至是非常严重的症状，这主要是因为活化的T 细胞释放出大量细胞因子所致，所以患者往往需要到ICU 病房接受治疗。

由于CAR治疗对某些患者起到了非常好的治疗效果，所以未来还将继续开展CAR相关的研究和临床试验工作。但是，依旧存在很多重要的问题等待我们解决。比如，哪种CAR设计策略会带来更好的治疗效果，同时进一步降低临床毒性？如何及时、有效地控制CAR介导的对健康组织的识别作用，以减少毒副作用？在实体瘤的治疗工作中，适应性T细胞治疗是否是一个有效的手段，能否起到和治疗血液系统肿瘤同样好的治疗效果？或者是否可以抑制肿瘤间质的作用？虽然CAR基因转移的难度更大，但是从远期效果来看，CAR基因转移的作用可能会更好。对于那些不太容易积累乘客突变，或者对细胞周期抑制药物不太敏感的肿瘤而言，TCR基因转移都是一个不错的选择。TCR基因能够特异性针对司机突变，所以与CAR基因转移治疗（CAR针对的都是细胞表面抗原，这些都不会是司机突变的编码产物）相比，产生耐药的可能性会更低。利用TCR基因编辑技术，破坏T 细胞原本的TCR编码基因，引入另外一个TCR或CAR基因，能够改变T 细胞的识别特异性，使其识别新的抗原。所以该技术能够很好地避免同种细胞表达两种不同TCR时经常发生的TCR错配问题。此外，在促进转基因T 细胞进行生物反应的同时，也能够抑制复杂的内源TCR信号转导作用。有越来越多的证据表明免疫细胞周期检查点抑制药物具有良好抗癌作用的同时，最近取得的CAR T细胞基因治疗结果也表明，免疫治疗有可能成为一种能够彻底根治癌症的新方法。

在本文介绍的一些使用AAV 病毒载体，针对肝脏的基因治疗临床试验中，针对转染肝细胞的延迟的细胞介导免疫反应带来的结果是可控的。这也给我们提供了一个需要密切注意的研究领域，因为我们现在对同时出现的能够触发免疫反应，同时对其进行时间调控的因素还不太了解。比如，与载体使用剂量相关的延迟肝细胞毒性作用发生的几率有多大？危害有多大？属于哪种类型的毒性作用？这也与同时发生的诱发因素有关，比如短暂的亚临床肝损伤，或转基因肝细胞因为持续表达病毒抗原，进而招募记忆T 细胞诱发的炎症反应。其它尚未解决的问题还包括转基因表达能够维持多长时间等。虽然在狗动物实验中观察到，AAV载体介导的凝血因子IX 表达能够维持很长的时间，几乎能够终身表达，但我们还是很难据此推测其在人体内的表达情况。如果能够清楚地了解AAV病毒DNA与肝细胞核之间长期关系的分子作用机制，以及这种关系对基因表达的影响作用，那么可能会为我们的工作带来一定的帮助。在临床前研究当中发现，有一部分AAV 病毒基因组会与肝细胞染色质整合到一起，虽然我们还不太清楚这种整合作用与凝血因子长期表达有什么关系。尽管这种整合对于外源基因的长期表达有好处，但是又会带来安全性方面的担心。我们必须开发出新的方法，让体内含有大量AAV 病毒中和抗体的患者也能够享受AAV基因治疗，或者多次接受AAV基因治疗。也许对AAV 病毒载体的衣壳蛋白进行改造是一种可行的方案。

随着对载体种类和使用剂量的信任度越来越高，不适合用AAV 载体的患者们也可以根据指南选择其它方案。新的血清型载体能够让以AAV 病毒为载体的基因治疗拥有更大的应用范围。比如，有可能解决最常见、也最难治的甲型血友病问题，还有其它严重的代谢异常疾病，比如影响肝脏、心脏和肌肉的代谢疾病。AAV基因治疗的强大功效通过简单的静脉注射，就能获得长期的临床获益，而且还很容易制备，不像体外细胞培养那么麻烦，所以很容易实现商业化生产，也容易大面积推广。AAV基因治疗也很适合解决那些目前还没有得到满足的医疗需要，比如在医疗保健水平不发达的国家。因为一次治疗就可以一劳永逸地解决问题，这样就不再需要终身使用麻烦且昂贵的替代治疗了。其它载体平台，比如慢病毒载体平台等也都在开发肝脏基因治疗项目，它们将弥补AAV 载体平台的不足，让更多的人用上这种新技术，让更多的疾病得到妥善的处置。

靶向基因编辑（Targetedgene editing ）

在基因治疗领域，另外一项重要的进展是靶向基因编辑（Targeted gene editing）技术的重大突破。这项技术已经能够人工构建能与特定DNA序列相结合的DNA内切酶，借助这种酶可以在DNA链上的特定部位形成双链断裂缺口（double-strand break,DSB），然后借助DNA修复机制引入外源序列。有了这种新技术，我们就能够更加方便，而且高效地对基因组进行定向编辑，比如进行基因定向破坏、插入或修复，这都是基因治疗的目标。所有这些策略都需要一种“打了就跑（hit and run ）”的机制，即在核内瞬时表达核酸酶及其它修复相关因子，完成使命之后随即“撤退”。因为这种基因编辑技术针对的是基因组中的某一个片段或区域，所以不存在随机插入风险，或者传统基因替代策略常常会出现的转基因表达水平不高等问题。

基因靶向疗法也已经借助适应性T细胞治疗平台进入了临床试验，这次选择的疾病是艾滋病。使用人工的锌指核酸酶（zinc-finger nuclease, ZFN ）破坏在体外培养的患者自体T 细胞的CCR5 编码基因，这是一种HIV 病毒细胞共受体（co-receptor ）编码基因。破坏之后，这些T 细胞就不会再被HIV 病毒感染。人工锌指核酸酶能够先在CCR5 基因的外显子区域形成一个DSB，然后通过非同源末端连接修复机制（non-homologousend-joining，NHEJ ）完成DSB修复，由于NHEJ 修复机制的保真度不高，所以会在修复时引入插入或缺失突变，从而起到破坏CCR5 基因功能的作用。该临床试验既证实了基因定向编辑技术的安全性，同时也证实该人工修饰细胞能够在人体内长期存在。此外研究人员还发现，人体对这种CCR5 基因被破坏了的细胞具有正向选择作用，有些受试者在中断服用抗病毒药物期间，体内HIV 病毒的复制水平也得到了控制。这些结果都表明，基因定向编辑技术具备很大的应用潜力。不过要实现彻底清除患者体内HIV 病毒的目的，还需要增加患者体内人工基因修饰细胞的数量。对此我们可以通过对具备自我更新能力的祖细胞，比如造血干细胞或T记忆干细胞等细胞进行基因修饰来完成。因为如果对患者进行预处理，清除掉他们体内的未修饰细胞之后，使用这些细胞进行基因治疗就非常有可能让体内的人工修饰T 细胞长期维持在一个较高的水平，从而获得很好的治疗效果。这种基因特异性破坏技术还可以用来重新激活被抑制的内源基因。比如抑制了红系祖细胞里的转录抑制因子BCL11 A 就可激活胎儿γ珠蛋白的表达，代偿β珠蛋白的作用，以治疗β地中海贫血或镰刀细胞贫血等疾病。不过由于我们还无法对已改造细胞进行定向选择培养，所以还需要想办法用更高的效率同时让两个等位基因全都失活。

如果利用同源指导（重组）修复（HDR）机制来修复DSB，那么基因编辑技术将发挥更加强大的功能，因为此时可以在DNA上的目标位点插入一段外源基因。此时我们需要给细胞内导入外源DNA模板（该序列上携带有与目标序列同源的片段），以及人工核酸酶。这种技术在体外基因治疗工作中有很大的用处，因为可以在基因组里预先选定好的“安全港”插入一段表达序列，或者在某突变基因处进行原位重组，通过这些方式都可以实现外源基因表达，而不用担心存在插入致癌的风险。不过也还存在一些问题需要解决。这是因为对于大部分用于基因治疗的原代细胞，比如造血干细胞而言，HDR介导的基因组编辑操作的效率还比较低。此外，由于需从体外培养的细胞中挑选出为数不多的已改造细胞进行治疗，所以安全性和可操作性也是一大问题。细胞DNA发生DSB之后，会发生哪种反应与细胞的种类和生长状态也有关系，既可能发生DSB修复，也可能进行分化，还有可能是凋亡。总体而言，我们还不太清楚，细胞究竟会选择NHEJ还是HDR途径进行修复。研究还发现，在细胞不处于S/G 2 期的时候，还可能存在另外一种HDR修复途径。

CRISPR/Cas 9  RNA核酸酶技术出现后，基因组编辑操作变得更容易。CRISPR/Cas 9  RNA核酸酶可以非常容易，而且快速地利用RNA向导链与任何DNA靶点结合，所以只需要合成一段RNA链即可，这是轻而易举的。目前已经在试验及临床前动物模型里探索出了好几个CRISPR/Cas9   基因组编辑技术的应用方向。不过要进入临床还需要进行一系列的检测和优化，比如脱靶情况的评估等。通过HDR或传统的病毒载体添加外源基因的同时也会破坏另外的基因，我们可以通过此现象来了解效应子的功能，比如在编辑T 细胞特异性的同时释放被抑制的细胞周期。

基因编辑策略还可以用于原位操作，比如肝细胞基因治疗等。乙型血友病小鼠模型动物实验发现，AAV 载体导入ZFN 和外源模板进行基因治疗之后，重组凝血因子IX 得以表达；同时还借助AAV载体导入CRISPR/Cas9 系统，定向破坏胆固醇调控基因Pcsk9 ；最后利用质粒导入CRISPR/Cas9 系统和模板，修复Fah突变基因。未来发展原位基因编辑技术的主要障碍包括安全性和临床上合适的载体输送系统，最理想的输送系统应该是只发挥一次作用（没有细胞毒性和免疫原性）。当前使用的所有人工核酸酶都或多或少地使用了原核生物（往往是病原细菌或腐生菌）的结构域。这些物质如果被注入人体，就有可能会引发免疫反应。最近，在小鼠动物实验中又验证了一个不依赖核酸内切酶的基因编辑策略。科研人员们利用无启动子的AAV 载体和与高度转录白蛋白基因同源的基因，针对肝细胞的白蛋白基因位点进行了转基因操作。结果有一小部分载体整合到白蛋白编码基因位点处，利用细胞自身的启动子完成了表达，在该试验中没有使用核酸内切酶，使用的载体上也没有携带启动子。不过该试验策略的转基因效率及其作用机制现在还不清楚。

视网膜基因治疗

对于身患严重退行性疾病的患者而言，基因治疗的最大好处可能体现在视网膜基因治疗方面。3 个临床试验都表明，给2 型Leber 先天性黑朦（type 2  Leber congenital amaurosis, LCA ）患者在视网膜下注入AAV2 载体，能够改善年轻患者的视敏度。不过其中有2 个临床试验发现，在2 ~ 3 年之后，治疗效果会消失。但是第3 个临床试验却得到了不一样的结果，他们发现患者能够获得持久的临床获益。该项目目前已经进入了3 期临床试验。这3 个临床试验全都采用了AAV2 载体，但至于为什么会得到不一样的试验结果，现在还不得而知。2 型Leber 先天性黑朦的病情会不断加重，这也给持续的临床获益带来一定的影响，因为经过治疗挽救的那一点感光细胞的作用最终会被视网膜自发发生的改变所掩盖。正如在肝脏基因治疗一节提到的那样，在载体设计和制备方面可能还存在一些微妙的小技巧，注射部位局部的炎症反应和转染细胞转基因重组的情况都会有所影响。更好使用的AAV 载体能够极大地提高治疗的安全性和转染效率，更严格的趋向性也有助于解决这些问题。

其它相关进展

在基因治疗领域，还有一些其它进展，但无法在本篇综述中详述。这其中包括应用于神经退化性疾病的治疗，其已经进入临床测试阶段。实验内容包括通过AAV 或者慢病毒载体将转基因输送到大脑，试验表明该方法安全性高，但疗效不尽如人意。提高载体剂量，或者优化载体设计可能有助于改善治疗效果。

溶瘤病毒可以感染和杀死癌细胞，在临床上的应用已经有些时日了。尽管这些病毒可以发挥强劲的抗癌活性，但是，仍然只在临床上作为联合治疗的一部分。溶瘤治疗主要利用病毒复制及诱导免疫反应来对抗感染细胞——在基因治疗策略中，通常会抵消免疫应答。令人迷惑的是，通过增加一个提高抗癌免疫诱导机制的转基因元件，其疗效往往会得到提高。

研究者还着手对来源于猿的腺病毒载体进行研究，评估其是否可以通过疫苗诱导机体的激素及细胞免疫。令人备受鼓舞的结果已经出现，试验表明，对传统疗法具有抵抗性的一些传染性疾病，可以通过此方法得到遏制。在临床前期模型中，研究者利用基因输送作为基础

的抗体治疗或预防策略，在体内建立了稳定、强劲、高量的抗体，这些抗体具有优化的特异性，可用于治疗和预防感染的发生。

未来展望

在下一个新千年，基因治疗可能会成为非常重要的一种治疗方法，因为其所发挥的作用，是传统药物所无法企及的。基因治疗可以将蕴含丰富信息的以基因为基础的蛋白表达进行靶向输送，促进生物学因子稳定、持续、可控地表达。此外，当和细胞治疗相结合时，基因治疗可以充当靶向基因输送的智能工具。正如本篇综述中所罗列的事例显示的那样，基因治疗可以引导强有力的生物学过程，促进疾病痊愈、组织修复以及再生。其治疗的稳定性、可靠性及强度，都可以通过遗传机制信息加以保证。在机体内，可以通过细胞的输送机制将基因治疗相关的物质定向输送到特异性的组织和病灶。基因治疗还利用干细胞的再生潜能和移植，以及机体免疫这一有利的生物学武器，发挥相应的治疗作用——机体免疫机能可以特异性消除发生改变或者被感染的细胞。通过对生物体内固有的这些功能的利用，基因治疗有潜力根治那些如今在医学领域或罕见、或常见的严重疾病，无论对患者还是整个社会，都是可以从中受益的

当然，想要实现这一愿望，还需要克服基因治疗中主要的一些难题。例如，基因转移载体的有效性和安全性，还需要通过基因工程进行进一步的设计及组装，加以改善，当然这可以通过使用合成分子，将不同病毒的生物学功能结合在一起来实现。这些技术上的进展，可以使载体精确瞄准组织及细胞类型，克服基因转导过程中来自细胞的限制性因素，绕过外源基因感受器。此外，还可帮助载体避免激活体内固有的适应性免疫系统。总而言之，技术上的改变能够确保转基因表达的可再生性、足够的表达强度、可持续性以及紧密模拟内源性基因表达模式（当基因替换发生时）。载体生产与描述方法的提高，可以对不同试验中采用的载体进行有效的比较，且有利于标准化的建立。原位基因的矫正与剪切，载体在安全的基因组范围内进行整合，采用人工核酶和外源修饰物对等位基因进行特异性沉默处理，所有这些都是基因治疗策略可以进一步改善的方面。对导致遗传性、多基因或获得性疾病的发病机制的更深入理解，也必将带来新的以基因为基础的治疗手段的出现。由于在基因转移过程中，采用了“活的”生物学药物，其复杂程度可谓前所未有，而且其可能对患者及细胞系造成超出预计的影响，因此必须在实施过程中，对患者进行长期跟踪观察，采取一定的预防性措施。此外，由于眼下对于干细胞调控、组织再生、免疫应答等方面的认识还相当有限，这限制了在进行基因治疗过程中可采取的干预手段，势必会让人们对可能出现的预计之外的坏的结果产生担忧。

从临床角度来看，给予患者基因及细胞学治疗，需要临床医生具备多学科的专业知识与技能，在有些情况下，还需要临床治疗机构具备高水平的细胞处理技术。临床医生需要学会分析生物学数据，以监测治疗的安全性和有效性。首个基因治疗药物已经从注册阶段走向了市场，在此过程中，制药公司及监管部门一直致力于建立药物生产及投放的质量标准，以便构建合理的渠道，为患者提供此类高度个性化的治疗方案。从社会学角度来看，基因治疗药物的生产，需要在传统卫生保障体系中提供“活的”生物学药物，具有相当的复杂性，并且花费不菲，这将给这类治疗的可持续性带来挑战，因此需要相关人员制定新的医疗费用-补偿政策，从而使所有患者都能从中获益。

最后，从伦理学角度来看，同等重要的是，我们应该思考这样一个问题，医学的发展应该是仅仅唯技术规则马首是瞻，还是应该对这一进程采取更加负责任的态度。例如，新技术的出现，可能会逐渐消减人类的自我认知能力，逐渐地，我们仅仅将自己看作是DNA的进化产物，DNA可以拥有自我意识，可以按照自己的想法进行自我剪切，并对后代产生相应的影响。现实中，我们禁止对人类生殖细胞的基因组进行剪切改造，说明技术的进步终将让我们身处伦理学上的两难境地。科学可能会再次向西方文化的古老根源寻找智慧的解决办法，正如古希腊的阿波罗神庙里所篆刻的碑文所述“了解你自己”——揭示世人认识自我的局限性。现代哲学训练我们以批判性思维审度知识的真实性与可靠性，这也是有局限性的，虽然这种方法帮助我们梳理事物间的关系、做出预测，但并不能揭示事物的本质。那些预测可以帮助我们构建新方法，让患者免受疾病之苦，从而提供一个框架，指引着我们做出正确选择，确保医学进展仍然建立在足够的伦理学基础之上。(欢迎分享本文，转载请保留原始出处)

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