病毒载体与基因治疗专题（一）：病毒载体概述
来源：仕必纯
分子生物学的发展促进了基因相关技术在精准医疗中的应用，即将基因和基于基因修饰的细胞治疗放在了医疗技术发展变革的最前沿，特别是对于目前尚不能满足的医疗需求，这种新型治疗技术的的潜力和重要性可与单克隆抗体相比。
但面对日益增加的市场需求，生物公司所面临的挑战也与日俱增，特别是基于病毒载体的治疗策略。
基因和基于基因修饰的细胞治疗方法是将治疗性DNA注入患者细胞，以达到治疗疾病的目的，包括体内和体外途径，其可用于替换或纠正错误的基因，或编码一个治疗性蛋白。新DNA的导入可使用针对靶细胞的治疗性转基因转导，即通过直接或基于细胞的基因治疗形式。
► 基于载体的基因递送
靶细胞递送指将“包装”后的载体导入原本“非许可”的细胞，其方法应可在一定程度上增强治疗效力，降低副作用。将基因治疗产品递送至目标位点，需选择合适的载体。基于载体的递送方法可大体分类为病毒或非病毒两类，理想的载体需具有一下特性：
· 严格控制的表达
· 低负作用
· 持续且可控的治疗性作用
· 靶细胞特异性
· 负载容量
一些基因治疗方法使用质粒DNA（pDNA）作为非病毒基因递送载体，其具有良好的安全特性、低毒性以及较大的基因负载，是病毒介导方法的有效补充，并兼容一系列的物理和机械递送策略。但易受一些“生理性屏障”的限制，如肾清除、溶酶体攻击以及血清内切酶的降解。
► 非病毒载体：机械和物理递送
多种机械和物理方法可用于将治疗性基因递送至其靶点，包括微注射、粒子轰击、激光辐照、电穿孔、声孔作用以及磁转染等，各种方法都可在一定程度上将核酸递送至靶细胞，且可避免病毒载体免疫原性相关的并发症，但又各自存在其局限性，特别是对细胞膜和细胞内环境的影响，此外，也缺乏对关键质量特性的控制。
如通常称为基因枪法的的粒子轰击技术，其使用重金属颗粒将特定的裸DNA质粒导入靶细胞，该过程有赖于多种参数的优化，包括颗粒的DNA载入、最终分布、递送时间以及其它复杂因素，综合优化挑战较大。而激光辐照方法指在特定光源条件下，靶细胞受影响的位点渗透性将增强，周围环境中的基因穿过膜进入细胞；电穿孔和声孔作用分别指将细胞置于电场或超声条件下，以在细胞膜上形成特定的“孔道”，使基因进入，这几种方法都存在一定的“随机性”，较难进行标准化控制，也易影响细胞原本的特性。
所以，目前约70%的基因治疗临床实验都采用基于病毒载体的系统。
病毒作为基因递送载体的优点是量大，且已良好定性，特别适用于基因信息的转化，所以其已成为临床研究的焦点。病毒的天然生命周期可分为两个不同的阶段：感染和复制。前者指病毒基因组被宿主细胞摄入以及随后的基因表达。用于基因治疗时，需用含修饰基因组的治疗性基因盒替换病毒基因组，然后导入靶细胞。
为保证治疗的有效性，进入细胞的治疗性基因材料数量需精确控制，以与相应疾病所呈现的特性相符。此外，遗传性疾病的治疗可能需要长期的基因表达，而不是短期或瞬时的。为达到此作用，仔细选择病毒载体是必要的前提。
► 腺相关病毒或慢病毒？
腺相关病毒（AAV）和慢病毒在基因治疗领域都有不少的适应症正在研发当中。
直接基因治疗或基于细胞的基因治疗方法的第一步，都是将治疗性转基因包装进递送载体，然后通过扩增宿主细胞系，以达到足够高的载体浓度。在直接基因的递送中，治疗性转基因直接注入体内目标组织；基于细胞的基因治疗要求分离并体外培养靶细胞，然后再对其进行基因性修饰，经扩增并富集后，重新输入患者体内。
多种不同类型的病毒可用于此目的，即将基因的功能性拷贝导入患者细胞。基于非病原性AAV的人细小病毒载体非常适合直接基因治疗。AAV载体的特点是低免疫原性，即在直接体内应用中相对安全。荷兰UniQure的阿利泼金是欧洲第一个商业化的基因治疗产品，其即为携带人脂蛋白脂肪酶（LPL）基因的AAV1载体，可通过肌肉注射用于家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）。
病毒载体可感染用于细胞治疗的分裂或非分裂细胞，其可基因性修饰靶细胞，包括T细胞或成熟细胞，以诱导相应的免疫功能或多能性。此应用过程取决于两个关键点：确定合适的治疗性基因，并在维持其有效属性前提下，将其成功递送至目标位点。
确定合适的治疗性基因并维持其最适转基因表达条件仍是基因治疗中较大的挑战，因为需要精确的转基因调节，以缓解不良效应。有两个关键基因元件可用于调节转基因表达：启动子和增强子。
启动子通常被分类为基本型或诱导型的，功能可以是通用的或特定于某些组织的，其可启动特定基因的“基本性”连续或“诱导性”瞬时转录。一般启动子具有稳定的转录活性和高度的特异性，如黑素细胞特异性酪氨酸酶启动子，但也有启动子效率较低，需要一定程度的“增强”以支持其作用。
增强过程可通过多种方法来达到，包括去除“死亡”的无功能启动子区域、复制具有正向调节元件的位点、组合不同组织特异性启动子以及使用重组转录激活因子，以促进DNA结合或反式激活等过程。当确定合适的治疗性基因后，其必需被有效递送至靶细胞。