基因编辑技术CRISPR/Cas最新研究进展
来源：生物谷
基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
我们整理了刚刚过去的5月份CRISPR/Cas研究方面的一些重要新闻报道，供大家阅读。
1.Cell:开发出基于CRISPR的方法研究lncRNA的功能
doi:10.1016/j.cell.2018.03.052
如今，在一项开创性的研究中，来自美国贝丝以色列女执事医学中心等研究机构的研究人员开发出一种新方法来鉴定和确定lncRNA在急性髓细胞白血病（AML）对化疗药物产生耐药性中所起的功能作用。这种新技术将来自公开可获得的药理学数据库的信息与前沿的CRISPR技术相结合，筛选影响治疗反应的编码基因和非编码基因。总而言之，这种全基因组筛查平台可用于鉴定和确定与许多健康情况相关的lncRNA的功能。相关研究结果发表在2018年4月19日的Cell期刊上，论文标题为“An Integrated Genome-wide CRISPRa approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance”。论文通信作者为贝丝以色列女执事医学中心的Pier Paolo Pandolfi教授。
图片来自Cell, doi:10.1016/j.cell.2018.03.052。
Pandolfi和同事们着重关注控制阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）耐药性的遗传学特征。阿糖胞苷是治疗AML的一种金标准化疗药物，然而30%～50%的AML患者会产生耐药性。在这项多步骤研究的第一阶段，这些研究人员将来自两个公开可获得的数据库---癌症靶点发现与开发（Cancer Target Discovery and Development）数据库和癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库---的信息进行交叉参考，以便鉴定出似乎与760种不同的细胞系对阿糖胞苷的敏感性和耐药性相关的基因。
为此，Pandolfi和同事们将生物信息学研究工作转移到体内测试。他们进行基于CRISPR的高通量筛选，以便独立地评估哪些基因可能决定着阿糖胞苷耐药性。这种CRISPR技术允许这些研究人员一次分析成千上万个编码基因和lncRNA，并可激活感兴趣的基因。这些研究人员随后利用阿糖胞苷处理细胞来观察这些基因如何作出反应。基因富集的丧失表明它在药物敏感性中发挥作用; 增强的基因富集意味着它介导耐药性。
2.Sci Rep：科学家利用基因编辑技术治疗艾滋病
doi:10.1038/s41598-018-26190-1
CRISPR/Cas9系统为编辑HIV-1病毒基因组提供了一种新的有潜力的工具，近日来自日本神户大学医学院感染疾病中心及健康科学研究生院国际卫生系的研究人员设计了一种RNA引导的CRISPR/Cas9以靶向HIV-1调节基因tat和rev，其中的引导RNAs（gRNA）都基于CRISPR的特异性设计，其靶向的序列在6种主要的HIV-1亚型中都保守存在。
在共转染前每个gRNA都被克隆进CRISPRv2慢病毒中，从而创造了慢病毒载体并将之转导进入细胞。和没有转染以及转染空载体的细胞相比，CRISPR/Cas9转染稳定表达Tat和Rev的293 T和HeLa细胞后，细胞中的这两个基因表达都被成功的抑制。
Tat功能试验显示转染tat-CRISPR显著抑制了HIV-1启动子驱动的荧光素酶的表达，而Rev功能试验则显示转染rev-CRISPR后gp120的表达被完全抑制。Cas9剪切位点的靶基因出现高频的各种程度的突变。值得注意的是，研究人员没有检测到任何非靶标靶位点出现突变，同时Cas9的表达对细胞的活性没有影响。
研究人员进一步在HIV-1感染的T细胞系中测试了他们的CRISPR/Cas9系统，结果发现就算进行细胞因子再刺激，p24的表达也被显著抑制，而同时使用6种gRNAs可以进一步增强编辑效率。因此利用CRISPR/Cas9系统靶向HIV-1调节基因也许是一种实现功能性治愈的有效方法。
3.Cell Rep：单次注射特殊制剂有望终生治疗B型血友病患者
doi:10.1016/j.celrep.2018.03.121
对于大多数B型血友病（hemophilia B）的患者而言，其机体无法正常形成血凝块，因此这些患者需要终生持续注射凝血因子来抑制疾病；如今来自索尔克研究所的研究人员通过研究表明，仅需要一次注射含有无病肝细胞的制剂就能产生小鼠所缺失的凝血因子，从而就能有效终生治疗患B型血友病的小鼠，相关研究刊登于国际杂志Cell Reports上，同时本文研究结果还能极大地改变科学家们诊断B型血友病的手段，并有望开发治疗B型血友病等其它遗传性障碍的新型疗法。
编码凝血因子IX (FIX)的基因出现缺失就会诱发B型血友病，血友病患者机体中凝血因子IX的水平通常较低，而且常会缺失功能性的基因版本，从而就会造成危及生命的血凝延迟状况；如今临床上常常使用由动物细胞制造并且纯化的FIX来给患者接种有效其病情，患者每周需要接种数次，但这种治疗手段比较昂贵、耗时，而且随着时间延续治疗效果将会越来越差。
本文研究中，研究人员开发了一种新方法，利用能够编码FIX基因的信使RNA来治疗工程化修饰患上B型血友病的小鼠，然而就像标准治疗一样，小鼠需要重复注射，而每次注射的信使RNA的剂量都非常小，因此科学家们就想尝试一种持久性的方法，即将能产生FIX的健康肝脏细胞移植到患者机体中。
研究者Suvasini Ramaswamy表示，这种基于细胞的方法的吸引力在于我们可以尽量减少患者需要治疗的次数，相比持续注射而言，我们可以一击命中。由于捐赠的肝脏通常都是短缺的，因此研究人员转向利用干细胞策略来产生健康的肝脏细胞，他们从两名严重B型血友病的患者机体中收集了血液样本(这些患者无法产生FIX)，随后在实验室中研究人员对这些细胞进行重编程使其成为诱导多能干细胞（ipsCs），而这些细胞就能够转化成为任何类型的细胞（包括肝细胞等），利用CRISPR/Cas9技术，研究人员就能修复每一位患者机体中的FIX基因突变，最终，研究人员就能诱导这些修复的细胞发育成为肝细胞样的前体细胞（HLCs），并将这些细胞移植到B型血友病患者机体中。
相比对血友病小鼠进行手术而言，研究人员能通过脾脏对HLCs进行移植，并将细胞均匀分布在肝脏中。这种新型的HLCs不仅能够产生FIX，而且其还能产生足够的蛋白质使得小鼠机体形成正常的血凝过程，同时这些细胞还能在移植后至少存活一年。对于血友病患者而言，利用其自身的细胞来产生健康的HLCs，随后再移植回患者机体中，就能有效避免患者出现的免疫排斥反应，但后期研究人员还需要进行更多的深入的研究才能将这种新技术转向临床试验阶段。
4.Nat Cell Biol：利用干细胞技术与基因编辑技术建立人类基因组功能蓝图
doi:10.1038/s41556-018-0088-1
最近，来自耶路撒冷的Hebrew大学的研究者们利用基因编辑技术以及人源胚胎干细胞技术绘制出了人类基因组的蓝图，揭示了基因对人体健康以及疾病发生的作用。相关结果发表在最近一期的《Nature Cell Biology》杂志上。
研究者们通过生成180000种不同的突变，对人类基因组中的所有基因功能进行了分析。其中，他们构建出了一种仅存在一对染色体的新型胚胎干细胞，并使用了CRISPR-CAS9技术进行大规模突变体的筛选。由于单倍体的特征，基因突变的构建相比野生型细胞更加容易。 研究者们发现，9%的基因对于胚胎干细胞的生长以及发育具有重要的意义，其中5%能够限制细胞的生长。此外，作者还分析了对胚胎干细胞早期生长发育有关的基因。另外一些引发癌症的基因也能够影响人胚胎的生长。
另一方面，这项研究还鉴定得到了一类对于胚胎干细胞具有特异性作用的基因簇。这些基因被认为参与维持了胚胎干细胞的性状，避免其癌化或分化形成成体细胞。
5.Blood：成功应用CRISPR/Case9进行体内HSPC基因编辑——重新激活成年小鼠红细胞的γ球蛋白表达
doi:10.1182/blood-2018-03-838540
涉及β球蛋白基因突变的疾病，主要包括β地中海贫血和镰刀型细胞病，代表了造血干/祖细胞（HSPC）基因疗法的主要靶点。上述基因疗法包括在成人CD34+细胞中用CRISPR/Case9介导基因编辑以重新激活红细胞内的胎儿γ球蛋白表达。
由于CD34+细胞红系分化的模型用于评估γ球蛋白再激活存在一定局限性，Chang Li等人建立人类β球蛋白位点的转基因小鼠（β-YAC）。研究人员利用一种辅助依赖性的靶向人类CD46的病毒载体，表达CRISPR/Case9（HDAd-HBG-CRISPR）来破坏γ球蛋白启动子区的抑制子结合区。研究人员在β-YAC/hCD46转基因小鼠体内转导HSPCs，然后将其移植到放射处理过的受体。
此外，研究人员还应用了一种体内HSPC转导方法，包括动员HSPC和静脉注射HDAd-HBG-CRISPR到β-YAC/hCD46转基因小鼠体内。在两种模型中，研究人员证实有效破坏目标位点可导致在成年小鼠红细胞内，人类β球蛋白表达明显变化γ球蛋白表达，而且该变化在第二次移植HSPCs后仍可维持。
在长时间的随访研究中，研究人员未检测到血液学异常，提示HBG启动子编辑不会负性影响造血功能。本研究是首个成功应用CRISPR/Case9进行体内HSPC基因编辑的研究。
6.Stem Cell Res：从患有非综合征性CLN3相关视网膜变性患者中成功建立诱导性多能干细胞系
doi:10.1016/j.scr.2018.04.014
澳大利亚大学眼科与视觉科学中心的Zhang X近日在Stem Cell Res发表了一篇文章，他们建立了人源晚发性非综合征视网膜色素变性的iPSC细胞系LEIi004-A。
该患者是由CLN3基因中杂合突变引起的晚发性非综合征视网膜色素变性，研究者从患者获取细胞，进行诱导培养后获得人类iPSC细胞系，命名为LEIi004-A。他们使用含有OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和针对p53的shRNA，以及mir302 / 367等microRNA的质粒转染细胞，对患者来源的原代真皮成纤维细胞进行重编程。他们还构建了对照的细胞系。具体操作是使用CRISPR / Cas9基因编辑的方法，在患者来源的iPSC细胞中纠正一个CLN3的突变，获得了iPSC细胞系，命名为LEIi004-A-1。
7.Ophthalmology：利用CRISPR有望治疗遗传性眼疾
doi:10.1016/j.ophtha.2018.04.001
在一项新的研究中，Stephen H. Tsang博士及其同事们发现使用两个向导RNA（gRNA）可将清除缺陷基因的效率从30%提高到90%。他们将这种基因组编辑技术与基因置换技术相结合，利用腺相关病毒将健康的基因导入视网膜中。他们采用客观的视力测试评估小鼠治疗后的视网膜功能，结果显示得到显着改善。
8.Blood：亚等位基因Rag1突变可在淋巴细胞早期发育阶段影响其免疫功能
doi:10.1182/blood-2017-12-820985
在迟发性联合免疫缺陷的肉芽肿和（或）自身免疫（CID-GAI）和外周T细胞和B细胞功能异常的患者中，发现了允许残存的T细胞和B细胞发育的亚等位基因RAG1突变。为检测亚等位基因Rag1突变是如何影响淋巴细胞发育的最初期阶段，Lisa M. Ott de Bruin等人利用CRISPR/Case9技术建立携带与CID-G/AI患者中发现的相同突变的小鼠模型，其研究结果于近日发表在Blood杂志上。
免疫学特征显示T/B淋巴细胞部分发育、存在幼稚细胞和血清免疫球蛋白，但抗体反应受损，而且存在自身抗体，良好的模拟了CID-G/AI患者的表型。
通过高通量测序发现，早期祖细胞的Igh V和Trb V基因的应用存在显着偏移，在分选后对生产性Igh和Trb重排存在偏差，B细胞祖细胞凋亡增加。Igk位点重排受损，而且可检测到多反应性IgM抗体。
总而言之，本研究为我们理解亚等位基因Rag1突变如何改变T/B淋巴细胞的主要功能提供新的见解，从而为经常在患者中看到的免疫失调奠定理论基础。
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